靜脈注射人骨髓間質(zhì)干細(xì)胞對(duì)大鼠局灶性腦缺血損傷的影響.pdf

1、目前為止，對(duì)腦血管疾病造成的神經(jīng)細(xì)胞死亡，沒(méi)有確實(shí)有效的治療方法。神經(jīng)系統(tǒng)常見(jiàn)病一缺血性腦血管病留下無(wú)法恢復(fù)的神經(jīng)功能缺損，給患者帶來(lái)極大的痛苦。目前國(guó)內(nèi)外研究人員從溶栓治療到介入微創(chuàng)治療，力求恢復(fù)腦缺血區(qū)血液供應(yīng)，保護(hù)受損神經(jīng)細(xì)胞，但因“時(shí)間窗”的限制，實(shí)際上只有極少數(shù)患者能及時(shí)接受溶栓治療，不管是超早期溶栓，還是其他積極的治療，都不能直接阻斷腦損傷的發(fā)生或促使受損組織再生。因此，利用神經(jīng)干細(xì)胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究，越來(lái)越引

2、起世界醫(yī)學(xué)界的關(guān)注，能夠替代缺損的神經(jīng)功能達(dá)到“無(wú)后遺癥”，才是治療的最終目的。神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)使人們改變過(guò)去所認(rèn)為的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后神經(jīng)元或軸突不能再生的觀點(diǎn)，并對(duì)許多神經(jīng)系統(tǒng)的疾病的治療帶來(lái)了新的希望。以往的神經(jīng)干細(xì)胞均來(lái)源于胚胎與成人神經(jīng)系統(tǒng)，其取材困難，存在倫理學(xué)問(wèn)題、移植后免疫排斥反應(yīng)，易誘發(fā)腫瘤等，其臨床應(yīng)用受限制，現(xiàn)基本棄用。臍帶血是神經(jīng)干細(xì)胞的另一重要來(lái)源，然而移植臍帶血來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞有很大的缺點(diǎn)，即異源性，需要長(zhǎng)久

3、使用免疫抑制劑去避免移植排斥反應(yīng)。骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)來(lái)源廣泛，取材容易，體外迅速擴(kuò)增，不存在倫理學(xué)問(wèn)題，可運(yùn)用自體移植，解除宿主可能的免疫排斥反應(yīng)，而具有良好的應(yīng)用前景。但目前hMSC移植后hMSC自身整合到受體組織，并分化成神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞，還是啟動(dòng)內(nèi)源性神經(jīng)元前體細(xì)胞的增殖，促使其向神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞分化，尚有爭(zhēng)議。 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)靜脈注射hMSC后觀察大鼠局灶性腦缺血損傷后的神經(jīng)功能評(píng)分、計(jì)算腦梗死面積、hMSC

4、到達(dá)腦缺血損傷部位后的存活程度、移植細(xì)胞及缺血周邊區(qū)、紋狀體區(qū)、室管膜下區(qū)神經(jīng)元前體細(xì)胞分化程度，最終闡明移植hMSC后改善神經(jīng)功能的部分分子學(xué)機(jī)制。 移植法包括病變部位立體定位直接注入法、腦脊液注入法、靜脈注射法等，但前兩者因副損傷大，難以在臨床上推廣，漸被靜脈注射法取代。hMSC靜脈注射劑量，在學(xué)者之間存在分歧，小劑量注射后hMSC到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)之前大部分停留在脾和肺，hMSC不能到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，當(dāng)然對(duì)神經(jīng)功能恢復(fù)起不到

5、效果。大劑量注射易引起栓塞，因此，目前提倡用(1-6)×10<'6>個(gè)劑量移植。本實(shí)驗(yàn)選擇1×10<'6>小劑量靜脈移植后取得了較滿意的效果。 實(shí)驗(yàn)首先選健康人類志愿者，抽取髂嵴中的骨髓10ml，離心法分離出hMSC，培養(yǎng)2w后熒光染劑PKt{26進(jìn)行標(biāo)記。實(shí)驗(yàn)組分為假手術(shù)組(A組，假手術(shù)+尾靜脈注射生理鹽水)，缺血再灌注組(B組，大腦中動(dòng)脈梗塞+尾靜脈注射生理鹽水)，骨髓干細(xì)胞組(C組，大腦中動(dòng)脈梗塞+尾靜脈注射hMSC)，h

6、MSC注射劑量為1×10<'6>用線栓法制作大鼠局灶性腦缺血模型，梗塞24h尾靜脈注射PKH26標(biāo)記的hMSC，每日腹腔注射5-溴脫氧尿苷嘧啶(BrdU)，標(biāo)記增殖的神經(jīng)元前體細(xì)胞。梗塞后第1、3、7、14d測(cè)定神經(jīng)功能評(píng)分，14d將全部動(dòng)物處死，計(jì)算腦梗死面積，免疫組化法測(cè)定缺血性大鼠腦中PHK26標(biāo)記的hMSC及NLNA標(biāo)記的hMSC及其分化，比較腦缺血后缺血周邊區(qū)、紋狀體區(qū)、同側(cè)腦室周?chē)夜苣は碌纳窠?jīng)元前體細(xì)胞分化程度。結(jié)果顯示，

7、hMSC移植后神經(jīng)功能明顯改善；腦梗死面積明顯縮小(P<0.05)；hMSC治療14d在大鼠腦缺血灶周?chē)_實(shí)發(fā)現(xiàn)PKH26標(biāo)記的hMSC，B組和C組均發(fā)現(xiàn)缺血周邊區(qū)、紋狀體區(qū)、室管膜下區(qū)神經(jīng)元前體細(xì)胞增殖，但C組增殖更顯著(P<0.01)，未觀察到NLNA標(biāo)記的細(xì)胞分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元的現(xiàn)象；觀察到BrdU標(biāo)記的細(xì)胞分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)總結(jié)出如下結(jié)論。①尾靜脈注射hMSC后移植的hMSC能到達(dá)缺血周邊部位，并部分

8、能成活。移植的hMSC只有向缺血區(qū)遷移才能完成對(duì)損傷的修復(fù)，本實(shí)驗(yàn)證明1×10<'6>個(gè)hMSC移植后移植細(xì)胞能遷移到缺血部位，與以往學(xué)者的觀點(diǎn)一致。②hMSC移植后神經(jīng)功能明顯恢復(fù)，腦梗死面積明顯縮小。C組hMSC移植后第1、3、7、14d定運(yùn)動(dòng)功能、感覺(jué)功能、改良的神經(jīng)功能損傷程度評(píng)分較B組有顯著性差異，從第3天開(kāi)始神經(jīng)功能明顯改善，第14天神經(jīng)功能改善最顯著。③移植的hMSC到達(dá)腦缺血部位后并不是自身分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元。h

9、MSC移植到腦內(nèi)后形態(tài)學(xué)上并未發(fā)現(xiàn)改變，故認(rèn)為hMSC移植后引起的功能恢復(fù)并不是移植的hMSC所產(chǎn)生的神經(jīng)元整合到宿主神經(jīng)環(huán)路所致。④}NSC移植后缺血周邊區(qū)、室管膜下區(qū)、紋狀體區(qū)神經(jīng)元前體細(xì)胞增殖，并分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元，從而改善腦缺血損傷。那么，移植的hMSC起什么作用呢?可能是移植的hMSC分泌的蛋白引起宿主腦組織可塑性上調(diào)，能改變?nèi)毖車(chē)h(huán)境，使缺血周邊區(qū)、紋狀體區(qū)、室管膜下區(qū)原存的靜止?fàn)顟B(tài)的神經(jīng)元前體細(xì)胞增殖，并促使其

10、分化成神經(jīng)元或星形膠質(zhì)細(xì)胞，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的修復(fù)和治療提供廣泛的前景。 盡管hMSC的移植取得了一些進(jìn)展，但對(duì)hMSC的基本生物學(xué)特征和免疫學(xué)特性尚未完全認(rèn)識(shí)，仍需進(jìn)一步深入研究最有效的細(xì)胞移植途徑，希望活體水平上監(jiān)測(cè)移植細(xì)胞的電生理特性，突觸聯(lián)系，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及釋放功能。hMSC移植后的體內(nèi)存活時(shí)間、安全性、體外培養(yǎng)的最適條件、探討和研究移植hMSC神經(jīng)生長(zhǎng)因子間的內(nèi)在聯(lián)系，找到}NSC分化不同階段的關(guān)鍵基因，將會(huì)為臨床上