正常人與關(guān)節(jié)炎患者血漿、滑膜細(xì)胞的差異蛋白質(zhì)組分析.pdf

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis，RA)是一種自身免疫性疾病，以非化膿性增生性滑膜炎為特點，逐漸導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的破壞及關(guān)節(jié)功能的障礙，該病呈進展性及破壞性。RA的發(fā)病機制不清，近幾十年的研究已證實感染和受抗原驅(qū)動的自身免疫反應(yīng)是RA發(fā)病和病情遷延的中心環(huán)節(jié)。近年來研究顯示滑膜成纖維細(xì)胞在RA的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著T細(xì)胞依賴途徑所不可解釋的重要作用，從而引起了人們的重視?；こ衫w維細(xì)胞在RA的發(fā)病中參與以下環(huán)節(jié)：(1)表現(xiàn)

2、出轉(zhuǎn)化細(xì)胞特征，類腫瘤樣異常增殖。(2)產(chǎn)生炎性介質(zhì)、促炎癥細(xì)胞因子及抗炎癥細(xì)胞因子調(diào)節(jié)炎癥及免疫反應(yīng)。(3)分泌基質(zhì)金屬蛋白酶等參與基質(zhì)降解以及骨破壞。(4)參與血管生成。 骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)通常被認(rèn)為是一種由生物力學(xué)改變和衰老而引起的退行性關(guān)節(jié)疾病，然而最近的研究發(fā)現(xiàn)OA的發(fā)病機制中有免疫反應(yīng)及滑膜炎癥反應(yīng)的參與。它們從不同的方面影響軟骨及骨的代謝過程，在疾病的發(fā)生、發(fā)展及持續(xù)過程中起著重要的作用

3、?；こ衫w維細(xì)胞作為關(guān)節(jié)炎癥最終的效應(yīng)細(xì)胞亦參與OA軟骨和骨破壞。 雖然滑膜成纖維細(xì)胞在關(guān)節(jié)炎中的作用已得到肯定，但其功能的分子機制仍不明確，如表型改變的機制?如何調(diào)控炎癥及免疫反應(yīng)?以何種方式與巨噬細(xì)胞及淋巴細(xì)胞相互作用?這些問題有待于進一步闡明。 差異蛋白質(zhì)組學(xué)為我們在全貌性分析蛋白質(zhì)組表達差異的基礎(chǔ)上探索細(xì)胞分子機制提供了可能。雙向凝膠電泳和基質(zhì)輔助飛行時間質(zhì)譜是差異蛋白質(zhì)組學(xué)常用的支柱性技術(shù)。在功能相關(guān)分子、標(biāo)志

4、物和藥物靶位篩選研究中的應(yīng)用顯示了此二種技術(shù)的價值。 本文首次應(yīng)用差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析了正常人及關(guān)節(jié)炎患者(RA、OA)滑膜成纖維細(xì)胞蛋白質(zhì)表達差異并對差異蛋白質(zhì)加以鑒定，以期探尋該細(xì)胞在不同疾病中功能特性的分子基礎(chǔ)，為進一步篩選特異性功能相關(guān)蛋白和干預(yù)靶位提供線索。同時利用血漿具有相對其他標(biāo)本易于獲取的優(yōu)勢，比較了正常人及RA患者血漿的蛋白表達譜，鑒定、分析差異蛋白，尋找疾病相關(guān)標(biāo)志蛋白分子，為早期診斷、尋找治療的靶標(biāo)提供新

5、的線索。具體研究結(jié)果如下： 1.運用雙向凝膠電泳技術(shù)獲得了正常人及RA患者血漿的蛋白表達譜，其中正常人血漿蛋白膠圖上平均顯示592個點，RA患者血漿蛋白膠圖上平均顯示563個點。通過圖象分析軟件對2-DE凝膠進行數(shù)字化量化比較分析，建立了蛋白質(zhì)組差異表達圖譜，并成功鑒定8個表達差異蛋白。這8個蛋白中，Ⅰ型磷脂酰肌醇-4-磷酸-5-激酶(PIP5K)、轉(zhuǎn)甲狀腺蛋白、結(jié)合珠蛋白(HP)、載脂蛋白A-I(ApoA-1)和Igmu鏈在R

6、A患者血漿中顯著高表達，補體C3較正常人明顯低表達。RA患者血漿中發(fā)生明顯變化的蛋白均與機體炎癥狀態(tài)及疾病活動性相關(guān)，它們通過不同的機制調(diào)控著機體的炎癥反應(yīng)。檢測血漿中這些蛋白的含量可作為了解機體炎癥狀態(tài)的指標(biāo)，亦有助于RA的早期診斷及疾病活動性的評價。 2.首次比較了正常人及關(guān)節(jié)炎患者(RA和OA)滑膜成纖維細(xì)胞的蛋白表達譜，建立了三種細(xì)胞蛋白質(zhì)組差異表達圖譜。其中正常人滑膜細(xì)胞蛋白膠圖上平均顯示852個點，RA患者滑膜細(xì)胞蛋

7、白膠圖上平均顯示837個點，OA患者滑膜細(xì)胞蛋白膠圖上平均顯示900個點。分別選取與正常人比較在RA滑膜細(xì)胞中高表達的34個差異蛋白點及在OA滑膜細(xì)胞中高表達的15個差異蛋白點進行了MALDI-TOF-MS，成功鑒定24個蛋白，這些蛋白包括結(jié)構(gòu)蛋白(Annexin，Galectin，LaminA/C，CRABP2，SNAPA)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白(GDIR，TCTP)、細(xì)胞代謝相關(guān)蛋白(ENOA，TPIS,LDHB)、鈣結(jié)合蛋白(S100

8、A4、S100A10)等。這些蛋白參與滑膜成纖維細(xì)胞的增殖、凋亡，炎癥調(diào)控，基質(zhì)降解等病理過程。為闡明滑膜成纖維細(xì)胞在關(guān)節(jié)炎中的作用提供了理論依據(jù)。 3.運用免疫印跡及免疫細(xì)胞化學(xué)方法，對差異蛋白Enolaseα、S100A4、S100A10、AnnexinI、CathepsinD、SOD2、Peroxiredoxin2在正常人、RA及OA滑膜成纖維細(xì)胞中的表達進行了驗證，證實這些差異蛋白均在關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞中表達升高，驗證了雙向