細胞外基質(zhì)裂解酶Heparanase-1與糖尿病視網(wǎng)膜病變新生血管形成的關系及作用機制研究.pdf

1、眼新生血管性疾病如角膜新生血管、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、年齡相關性黃斑變性等，是以糖尿病視網(wǎng)膜病變?yōu)槭椎囊唤M嚴重危害患者視功能的常見致盲性眼病。新生血管的形成機制尚不十分清楚，目前亦無理想的治療方法。在眾多的促血管生長因子中，血管內(nèi)皮生長因子在細胞增殖、遷移和黏附等信號轉(zhuǎn)導的起始反應中起關鍵性作用，但是直接抑制VEGF及其受體并不能完全阻止病理性新生血管的發(fā)生，因而新生血管的形成是一個多因素、多途徑參與的復雜病理過程，找到各種促血管生長因子的

2、上游調(diào)控樞紐是阻止新生血管形成的關鍵。眾所周知，細胞外基質(zhì)在細胞接觸、生長和分化過程中起重要作用，是各種細胞因子的“儲存庫”，其主要成分之一硫酸乙酰肝素蛋白聚糖由一個蛋白核心和數(shù)個與之共價連接的線性硫酸乙酰肝素側(cè)鏈組成，其HS側(cè)鏈可以結(jié)合、儲存各種生長因子如：FGFs，VEGF和PDG等。在大血管中HSPG主要位于內(nèi)膜和中層，而在毛細血管中主要位于內(nèi)皮下的基底膜，促進內(nèi)皮細胞的增生、遷移，以及穩(wěn)定毛細血管的結(jié)構(gòu)。乙酰肝素酶是一種內(nèi)源性β

3、-葡萄糖醛酸酯酶，是細胞外基質(zhì)重要的裂解酶，HSPG是其特異性底物，Hpa識別HS側(cè)鏈的特異位點，將HS降解為10-20個糖單位大小的短糖鏈，釋放HS結(jié)合的細胞生長因子，在許多生理、病理過程如形態(tài)發(fā)生、組織修復、炎癥、腫瘤新生血管形成和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。因而，Hpa-1可能是控制各種活性細胞因子釋放的上游樞紐。為我們研究病理性新生血管形成的機理提供了思路。 Hpa有兩種基因亞型，Hpa-1與Hpa-2。兩者有35％的同源性

4、，其組織分布和細胞定位不同，可能有著不同的生物學功能。與新生血管關系密切的是Hpa-1，定位于染色體4q21.3。目前Hpa抑制劑的設計主要根據(jù)HS或其類似物。研究較多的是硫酸化磷酸甘露戊糖，PI-88在結(jié)構(gòu)上與HS相似，與HS競爭性結(jié)合生長因子如：FGF-2和VEGF，阻止生長信號傳遞到細胞，抑制新生血管形成。PI-88的研究已進行到多中心Ⅲ期臨床評價。 本課題擬觀察糖尿病視網(wǎng)膜病變患者Hpa-1的表達及抑制劑PI-88在糖尿

5、病視網(wǎng)膜病變中的作用，探討Hpa-1與視網(wǎng)膜新生血管形成的關系及其作用機理。目前國內(nèi)外尚未見Hpa-1與視網(wǎng)膜新生血管關系的研究報道。 第一部分糖尿病視網(wǎng)膜病變患者外周血中Heparanase-1的表達 目的：觀察糖尿病視網(wǎng)膜病變患者外周血Hpa-1的表達，探討Hpa-1表達與糖尿病視網(wǎng)膜病變的關系。 方法：50例糖尿病視網(wǎng)膜病變患者和15例健康人分為三組，Group1：正常對照組；Group2：非增殖期糖尿病視

6、網(wǎng)膜病變組；Group3：增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變組。收集每位受試對象枸櫞酸抗凝的外周血6ml，密度梯度離心法分離外周血中單個核細胞。應用免疫細胞化學染色、RT-PCR和Western Blot方法檢測PBMC中Hpa-1的表達。 結(jié)果：mRNA水平，正常對照組、NPDR組和PDR組均可檢測到Hpa-1的表達。經(jīng)半定量分析，NPDR組、PDR組患者Hpa-1高表達，分別是正常對照組表達的1.28倍和1.33倍，差異具有統(tǒng)計學意義(

7、P≤0.05)，NPDR與PDR組間差異無統(tǒng)計學意義(P≥0.05)。蛋白水平，PBMC的免疫細胞化學染色示Hpa-1陽性染色的細胞胞漿為棕色著染，通過400倍光鏡下陽性細胞計數(shù)，三組的陽性細胞數(shù)NH組：24.80％±3.24％，NPDR組：54.97％±13.01％，PDR組60.49％±8.66％，NPDR組、PDR組與NH組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P≤0.05)，NPDR與PDR組間差異無統(tǒng)計學意義(P≥0.05)；Western

8、 Blot分析，三組均可檢測到Hpa-1基因65KD前體蛋白和50KD活性蛋白的表達，NPDR組、PDR組高表達Hpa-1，分別是NH組的2.88倍和3.18倍，差異具有統(tǒng)計學意義(P≤0.05)，NPDR與PDR組間差異無統(tǒng)計學意義(P≥0.05)。 結(jié)論：糖尿病視網(wǎng)膜病變患者外周血中Hpa-1高表達，提示Hpa-1可能參與了糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生發(fā)展。 第二部分 Heparanase-1在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的動態(tài)表達

9、及與ICAM-1和VEGF表達的關系 目的：觀察Hpa-1在STZ—糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的動態(tài)表達及其對ICAM-1、VEGF表達的調(diào)節(jié)作用，探討Hpa-1的可能作用機制。 方法：8周齡雄性SD大鼠，腹腔注射STZ誘導糖尿病大鼠動物模型。分正常對照組、糖尿病兩周組和糖尿病三個月組，糖尿病大鼠分別在STZ注射后兩周、三個月處死。取大鼠視網(wǎng)膜組織，提取總RNA，RT—PCR方法檢測Hpa-1以及ICAM-1、VEGF的表達。

10、 結(jié)果：糖尿病2周、3個月的大鼠視網(wǎng)膜組織Hpa-1的表達分別是正常對照組的1.13倍和1.46倍；ICAM-1的表達分別是正常對照組的1.30倍和1.66倍；VEGF的表達分別是正常對照組的1.46倍和1.77倍。三組間Hpa-1、ICAM-1和VEGF表達均存在統(tǒng)計學差異(P≤0.05)。 結(jié)論：糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織Hpa-1表達增加，且與糖尿病病程呈正相關。ICAM-1、VEGF表達增加，與Hpa-1的表達一致。Hp

11、a-1可能是ICAM-1、VEGF表達的上游調(diào)控因子而在糖尿病視網(wǎng)膜病變的炎癥反應、新生血管形成過程中起重要作用。 第三部分Heparanase-1抑制劑PI—88在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變中的作用及其視網(wǎng)膜毒性的研究 目的：觀察Heparanase-1抑制劑PI—88在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜病變中的作用及其視網(wǎng)膜毒性研究。 方法：8周齡雄性SD大鼠38只，STZ腹腔注射誘導糖尿病大鼠動物模型。隨機分正常對照組(norma

12、l rat，NR，n＝8)、正常大鼠PI—88(25mg/kg/d，腹腔注射)給藥組(NR+PI—88，n=6)、糖尿病組(diabetic rat，DR，n=8)、糖尿病大鼠PI—88(25mg/kg/d，腹腔注射)給藥組(DR+PI—88，n=8)和糖尿病空白對照組(腹腔注射等量生理鹽水，DR+NS，n=8)。糖尿病大鼠在STZ注射三個月后開始PI—88給藥，在給藥的0、7、14天監(jiān)測大鼠體重和血糖。PI—88連續(xù)給藥14天，所有大

13、鼠行視網(wǎng)膜ERG檢查后處死，摘除眼球，做石蠟切片、提取總RNA。其中NR組、DR組、DR+PI—88組和DR+NS組行ERG檢查視網(wǎng)膜功能、免疫組織化學染色和RT—PCR方法檢測視網(wǎng)膜Hpa-1和VEGF表達來評價PI—88治療作用；NR組和NR+PI—88組ERG和石蠟切片HE染色后光鏡下觀察大鼠視網(wǎng)膜組織學變化來評價PI—88的視網(wǎng)膜毒性。 結(jié)果：PI—88以25mg/kg/d劑量腹腔注射14天，對所有大鼠飲食、睡眠和體重無

14、明顯影響。視網(wǎng)膜閃光ERG示DR+PI—88組較DR和DR+NS組a波、b波潛伏期縮短，振幅增加，差異有統(tǒng)計學意義(P≤0.05)。RT—PCR半定量分析示DR+PI—88組較DR組和DR+NS組視網(wǎng)膜Hpa-1、VEGF表達下降，其中較DR組Hpa-1、VEGF表達分別下降24.4％和30％，差異有統(tǒng)計學意義(P≤0.05)。視網(wǎng)膜毒性分析ERG示NR+PI—88組與NR組間a波、b波潛伏期、振幅無統(tǒng)計學差異(P≥0.05)；光鏡下N

15、R+PI—88組和NR組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞層均可見空泡形成，光感受器外層有斷裂，與組織自溶程度一致，兩組大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)無差別。 結(jié)論：PI—88可以降低糖尿病大鼠視網(wǎng)膜功能的損害，抑制糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織Hpa-1的表達，下調(diào)VEGF表達，可能對視網(wǎng)膜新生血管形成有抑制作用。SD大鼠25mg/kg/d腹腔注射PI—88兩周，無視網(wǎng)膜毒性。 第四部分 Heparanase-1在高糖條件下體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞中

16、的表達及與ICAM-1和VEGF的關系 目的：觀察Hpa-1在高糖條件下體外培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞(human retinal capillary endothelial cells，HRCECs)中的表達及其與ICAM-1、VEGF的關系，及PI—88對HRCECs增殖的影響。 方法：體外培養(yǎng)、鑒定人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞，高糖(30mmol/l)條件下培養(yǎng)HRCECs72小時，RT—PCR方法檢測Hpa-1、IC

17、MA-1和VEGF的表達。MTT法檢測PI—88(5μg/ml和10μg/ml)對正常HRCECs增殖的影響。 結(jié)果：成功培養(yǎng)了原代人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞。高糖條件下HRCECs Hpa-1、ICAM-1和VEGF表達分別增加1.6倍、2.2倍和2.18倍，其表達上調(diào)可被PI—88(5μg/ml)顯著抑制，P值分別為0.003、0.000和0.000(P≤0.05)。PI—88干預HRCECs24小時，各組細胞增殖率無統(tǒng)計學差異