原癌性轉(zhuǎn)錄因子CREB通過調(diào)控miRNA的表達(dá)影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長和遷移.pdf

1、神經(jīng)膠質(zhì)瘤（glioma，以下簡稱膠質(zhì)瘤）是最常見，也是致死率最高的腦部腫瘤，目前尚無有效的藥物治療方法。研究膠質(zhì)瘤發(fā)病的分子機(jī)制，將有助于我們找到有價(jià)值的分子靶點(diǎn)，從而為腫瘤的靶向治療提供思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。近年來，人們對于在膠質(zhì)瘤中表達(dá)發(fā)生改變的miRNA進(jìn)行了大規(guī)模的芯片篩查，并對其中一些差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行了功能分析，而這些原癌性或抑癌性的miRNA表達(dá)失調(diào)的原因有待發(fā)掘。找出這些miRNA表達(dá)改變的原因?qū)⒂兄诟娴睦斫饽z質(zhì)

2、瘤發(fā)病原因，從而找到關(guān)鍵的藥物靶點(diǎn)或更有效的治療思路。作為在多種腫瘤中高表達(dá)并發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，CREB(cAMP response element-binding protein)被認(rèn)為是一個重要的原癌基因，參與到腫瘤細(xì)胞的增殖、存活及轉(zhuǎn)移等各個方面的調(diào)節(jié)。然而CREB在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及功能卻有待研究。
　　 首先，我們證明了CREB在膠質(zhì)瘤中高表達(dá)并促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長和存活。我們在兩例正常腦組織和十五例神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織

3、以及四株膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(U87MG、T98G、A172和U251)中檢測了CREB的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)CREB在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系呈現(xiàn)高表達(dá)。利用定量PCR檢測CREB在三例膠質(zhì)瘤組織和四株膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的基因拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)在一例IV級膠質(zhì)瘤組織和四例膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中CREB基因出現(xiàn)擴(kuò)增現(xiàn)象。在三株膠質(zhì)瘤細(xì)胞系（U87MG、T98G和U251）中利用siRNA敲低CREB后，腫瘤細(xì)胞的生長、存活及克隆生長明顯受到抑制，并且敲低CREB可以明顯抑制

4、T98G和U251細(xì)胞在軟瓊脂中的克隆生長能力。同時(shí)，用腺病毒導(dǎo)入的shcreb敲低CREB能顯著抑制U87MG和U251細(xì)胞在裸鼠皮下的成瘤能力。有意思的是，用腺病毒導(dǎo)入的shcreb敲低CREB可以明顯抑制T98G和U251的生長或存活而對人宮頸癌細(xì)胞系HeLa和正常人膠質(zhì)細(xì)胞系HEB無明顯影響。
　　 其次，我們證明了CREB可以廣泛調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miRNA的表達(dá)，并可以直接調(diào)控mir-9和mir-23a的表達(dá)。在膠質(zhì)瘤

5、細(xì)胞系T98G中敲低CREB會引起廣泛的miRNA水平的下調(diào)，而ChIP-chip和ChIP-QPCR以及報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)CREB直接調(diào)控了mir-9及mir-23a的轉(zhuǎn)錄。
　　 接下來，我們證明mir-23a和mir-9分別促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長和遷移，并對它們的靶基因做了初步探討。我們發(fā)現(xiàn)在三株膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中敲低mir-23a可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長和存活。而在T98G和U251細(xì)胞中敲低CREB的同時(shí)過表達(dá)mir-23a可以

6、部分回復(fù)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長、存活能力。通過生物信息學(xué)預(yù)測我們發(fā)現(xiàn)三個關(guān)鍵的抑癌基因（FoXO3a、FoXO4及PTEN）是潛在的mir-23a的靶基因，而熒光素酶報(bào)告基因的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了這三個基因的3'UTR可以被mir-23a所調(diào)控。通過三個抑癌基因在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的蛋白表達(dá)水平以及過表達(dá)或敲低mir-23a對其蛋白水平的影響，我們認(rèn)為FoXO3a及PTEN的蛋白水平可能受到mir-23a的調(diào)控。敲低CREB后FoXO3a蛋白水平下調(diào)而P

7、TEN上調(diào)，提示PTEN更可能受到CREB所調(diào)控的mir-23a的調(diào)節(jié)。在三株膠質(zhì)瘤細(xì)胞系（U87MG、T98G和U251）中敲低mir-9能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移。我們發(fā)現(xiàn)敲低CREB可以抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移能力。
　　 最后，我們利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和蛋白水平的檢測證明mir-9可以在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中直接靶向CREB的3'UTR，提示mir-9和CREB可能形成一個負(fù)反饋環(huán)路。
　　 總之，我們證明CREB在膠質(zhì)瘤組