CTLA-4 siRNA轉(zhuǎn)染慢性乙型肝炎患者外周血淋巴細(xì)胞增強(qiáng)乙肝免疫的研究.pdf

1、目的：探討慢性乙型肝炎（CHB）患者外周血淋巴細(xì)胞細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）表達(dá)與血清HBV-DNA之間的相關(guān)關(guān)系；探討化學(xué)合成的小干擾RNA（RNA，siRNA）對(duì)CHB患者外周血淋巴細(xì)胞CTLA-4基因表達(dá)的抑制作用，同時(shí)觀察干擾后對(duì)IFN-γ、IL-2和IL-4分泌的調(diào)節(jié)，從而觀察干擾CTLA-4基因后的免疫激活作用，為CHB治療提供新思路。 方法：①用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)39例CHB患者外周血淋巴細(xì)胞C

2、TLA-4 mRNA和血清中HBV-DNA的含量。②根據(jù)人淋巴細(xì)胞共刺激分子CTLA-4的基因序列，設(shè)計(jì)并合成3條含21個(gè)堿基的siRNA(siRNA1，siRNA2，siRNA3)及隨機(jī)陰性對(duì)照(siRNA-co)。用電穿孔法轉(zhuǎn)染30例CHB患者外周血淋巴細(xì)胞，分別于轉(zhuǎn)染后24h、48h和72h收集細(xì)胞，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)淋巴細(xì)胞CTLA-4 mRNA的表達(dá)，并于轉(zhuǎn)染后48h 用Western Blot檢測(cè)淋巴細(xì)胞CTLA-

3、4蛋白的表達(dá)，從三對(duì)siRNA中選出最有效的siRNA進(jìn)入接下來(lái)的試驗(yàn)。③將選出的siRNA轉(zhuǎn)入92例CHB患者外周血淋巴細(xì)胞中，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)IFN-γ、IL-2和IL-4分泌。 結(jié)果：⑴CHB患者外周血淋巴細(xì)胞CTLA-4的表達(dá)與血清HBV-DNA呈正相關(guān)。⑵與陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染siRNA 24h、48h和72h，三對(duì)siRNA對(duì)CTLA-4 mRNA均有抑制作用，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異（P<0.01）。

4、siRNA1、siRNA2和siRNA 3均在48h對(duì)CTLA-4 mRNA的抑制作用最強(qiáng)，明顯大于24h和72h（P<0.01）。其中siRNA1在48h對(duì)CTLA-4 mRNA的抑制效率最高，達(dá)（67.07±4.36）％。轉(zhuǎn)染48h三對(duì)siRNA對(duì)淋巴細(xì)胞CTLA-4蛋白表達(dá)均有抑制作用，且siRNA1的抑制作用最強(qiáng)。⑶與各對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組上清液IFN-γ和IL-2的檢測(cè)水平具有顯著性差異（P<0.01)，而IL-4的檢測(cè)水平無(wú)顯