濾泡輔助性T淋巴細(xì)胞與B淋巴相互作用在慢性乙型肝炎的研究.pdf

1、慢性乙型病毒性肝炎作為感染性疾病與機(jī)體免疫應(yīng)答具有密切的關(guān)系,特異性體液免疫反應(yīng)通過(guò)分泌保護(hù)性抗體,以ADCC、中和作用等方式參與機(jī)體對(duì)乙肝病毒的清除,但其詳細(xì)的機(jī)制缺乏深入研究。自發(fā)或經(jīng)治療獲得HBeAg/HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換被認(rèn)為是乙肝病毒感染后機(jī)體免疫應(yīng)答的重要標(biāo)志,B淋巴細(xì)胞是抗體分泌過(guò)程的中心環(huán)節(jié),在輔助性T淋巴細(xì)胞的促進(jìn)作用下,不同亞型的B淋巴細(xì)胞可以增殖、分化形成為漿細(xì)胞,從而維持抗體的型別轉(zhuǎn)換與分泌。因此研究T-B細(xì)胞相

2、互作用的關(guān)系對(duì)了解機(jī)體抗HBV特異性體液免疫應(yīng)答機(jī)制具有重要意義。
　　 第一章慢性乙型肝炎外周血Tfh細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞表型及分布研究
　　 目的：觀察脾臟與外周血來(lái)源的Tfh細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞表達(dá)差異;檢測(cè)抗病毒治療條件下,血清轉(zhuǎn)換前后的慢性乙型肝炎患者外周血Tfh細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞分布水平、以及相關(guān)功能分子表達(dá)的變化,為進(jìn)一步研究Tfh細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞相互作用在乙肝抗病毒治療中的臨床意義提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法

3、：
　　 1研究對(duì)象選擇:未進(jìn)行抗HBV-DNA病毒治療的HBeAg+的慢性乙型肝炎患者、經(jīng)抗病毒治療后獲得HB eAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換且HBV-DNA陰性的CHB患者、健康志愿者、乙肝肝硬化脾亢行脾切除術(shù)患者。
　　 2流式細(xì)胞儀檢測(cè):取各組研究對(duì)象外周血2 ml以及分離獲得脾臟來(lái)源淋巴細(xì)胞懸液,以相應(yīng)抗體標(biāo)記,檢測(cè)Tfh細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞的細(xì)胞表型與百分率;
　　 3酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè):取各組研究對(duì)象外周血5 ml

4、,分離制備血清,ELISA試劑盒檢測(cè)外周血IL-21水平。
　　 4統(tǒng)計(jì)分析:采用spss17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù);采用Kolmogorov-Smimov檢驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)正態(tài)性,Levene檢驗(yàn)檢測(cè)方差齊性;采用配對(duì)資料的t檢驗(yàn),檢測(cè)配對(duì)資料兩組數(shù)據(jù)的差異;采用單因素方差分析或秩和檢驗(yàn)檢測(cè)各組數(shù)據(jù)差異性;采用Spearman檢驗(yàn)或Pearson檢驗(yàn)相關(guān)性分析檢測(cè)外周血Tfh細(xì)胞與B細(xì)胞頻數(shù)與表達(dá)分子等實(shí)驗(yàn)指標(biāo)與慢性乙型肝患者病毒學(xué)以

5、及生物化學(xué)等臨床指標(biāo)的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：
　　 1流式細(xì)胞儀鑒定不同來(lái)源的Tfh與B細(xì)胞表型分別以Tfh(CD4+CXCR5+)細(xì)胞與B(CD19+)淋巴細(xì)胞設(shè)門(mén),檢測(cè)脾臟與外周血來(lái)源的兩類細(xì)胞膜表達(dá)分子水平:外周血來(lái)源的Tfh細(xì)胞膜上CCR7分子表達(dá)高于脾來(lái)源Tth細(xì)胞膜上CCR7分子,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05):IL-21R在兩組Tfh細(xì)胞膜上表達(dá)無(wú)顯著性差異;而PD-1、ICOS等分子在外周血來(lái)源的Tf

6、h細(xì)胞膜則表達(dá)低于脾Tth細(xì)胞,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);此外,CD38分子、IL-21R分子在外周血來(lái)源的B淋巴細(xì)胞上表達(dá)顯著高于脾臟B細(xì)胞(P＜0.05),CD27分子在兩組B細(xì)胞表達(dá)無(wú)顯著性差異,而PD-1分子則在在外周血來(lái)源的B淋巴細(xì)胞上表達(dá)較脾臟B細(xì)胞低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);
　　 2流式細(xì)胞檢測(cè)循環(huán)Tfh細(xì)胞分泌細(xì)胞因子PBMC經(jīng)胞內(nèi)染色,以Tfh(CD4+CXCR5+)細(xì)胞設(shè)門(mén),流式細(xì)胞儀

7、檢測(cè)循環(huán)Tfh細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子水平:循環(huán)Tfh細(xì)胞可分泌較高水平的IFN-γ(2.23±0.82),而分泌的IL-21(0.95±0.31)、IL-4(0.80±0.35)以及IL-17(0.93±0.48)水平較低;
　　 3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)循環(huán)Tfh細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞表型與百分率變化采集三組研究對(duì)象外周血后,經(jīng)流式抗體表面染色,流式細(xì)胞儀器檢測(cè)外周血中Tth、B細(xì)胞以及細(xì)胞相關(guān)表達(dá)分子的變化差異顯示:健康志愿者外周血中的Tf

8、h細(xì)胞(5.65±2.51),CCR7+Tfh(11.58±4.21)細(xì)胞以及漿細(xì)胞(1.36±0.55)細(xì)胞頻數(shù)以及漿細(xì)胞上表達(dá)PD-1表達(dá)水平(4.38±2.05)顯著低于CHB患者(P＜0.05);盡管未抗病毒治療者外周血Tfh(8.54±3.08)與CCR7+Tfh(14.43±5.91)低于抗病毒治療者(9.78±3.14,14.75±5.05),而未抗病毒者(PD-1/PLA:8.56±3.50)外周血漿細(xì)胞上表達(dá)PD-1表

9、達(dá)水平高于抗病毒治療者(PD-1/PLA:7.82±4.34),但兩組數(shù)據(jù)并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05),此外,漿細(xì)胞在治療者顯著低于治療者(治療者:5.23±1.21,治療者:2.44±0.87);總B淋巴細(xì)胞頻數(shù)與漿細(xì)胞上IL-21R表達(dá)水平在三組研究對(duì)象并無(wú)顯著差異(健康:4.56±2.71,56.13±27.76;未治療者:3.88±1.68,52.21±22.75;治療者:4.62±2.00,46.75±22.43);

10、　　 4 ELISA檢測(cè)血清IL-21水平定量檢測(cè)各組研究對(duì)象血清IL-21發(fā)現(xiàn):與健康對(duì)照組(407.29±65.75)相比,C船患者血清IL-21水平明顯升高(P＜0.05),但兩組患者無(wú)顯著性差異(未治療者:536.60±109.44;抗病毒治療者:488.69±105.76);
　　 5臨床相關(guān)性分析將20慢性活動(dòng)性乙型肝炎患者外周血實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)與臨床檢測(cè)(ALT,HBV-DNA等)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn):循環(huán)Tfh

11、細(xì)胞,漿細(xì)胞頻數(shù)與肝功能指標(biāo)以及病毒滴度不存在相關(guān)性,而漿細(xì)胞表達(dá)的IL-21R與PD-分子成負(fù)相關(guān)(P＜0.01),同時(shí)還與病毒水平存在正相關(guān)(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1外周血來(lái)源與脾臟來(lái)源的Tfh細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞表型不完全一致,外周血Tfh表達(dá)的CCR7+分子高,而PD-1,ICOS分子表達(dá)低,IL-21R在兩者表達(dá)相近;此外,外周血B表達(dá)的CD38,IL-21R分子高,PD-1分子低,CD27表達(dá)相近

12、,推測(cè)循環(huán)Tfh可能是Tfh細(xì)胞的一個(gè)子型;
　　 2外周血來(lái)源的Tfh細(xì)胞不僅僅分泌IL-21,還能分泌高水平的INF-γ,以及一定水平的IL-17與IL-4,可能介導(dǎo)細(xì)胞發(fā)揮一定的直接抗病毒作用;
　　 3發(fā)在抗病毒治療過(guò)程中,隨著HB e抗原的消失與抗HB e抗原抗體的出現(xiàn),Tfh細(xì)胞的在外周血的表達(dá)水平是增高的,且以CCR+Tfh細(xì)胞升高為主;總的B淋巴細(xì)胞表達(dá)水平不發(fā)生變化,但漿細(xì)胞水平是增高的,同時(shí)將細(xì)胞表達(dá)

13、的PD-1分子水平在各組也有顯著差異,推測(cè)慢性乙型肝炎患者外周血CCR7+Tfh細(xì)胞與漿細(xì)胞在機(jī)體的抗病毒免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用;
　　 4慢性乙型肝炎患者外周血血清IL-21水平高于健康志愿者,但血清學(xué)轉(zhuǎn)換前后無(wú)差別,說(shuō)明IL-21在乙型肝炎疾病的發(fā)生階段發(fā)揮做重要作用,但其主要來(lái)源與具體作用仍需進(jìn)一步研究;
　　 5臨床相關(guān)性分析提示,ALT與漿細(xì)胞表達(dá)的IL-21R和PD-分子呈負(fù)相關(guān)(P＜0.01),同時(shí)還與

14、病毒水平存在正相關(guān),推測(cè)漿細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫參與肝臟炎癥的發(fā)生;
　　 第二章體外研究Tfh細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞之間相互作用
　　 目的：
　　 體外研究不同細(xì)胞因子刺激下Tfh細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞之間的相互作用,為進(jìn)一步研究T-B細(xì)胞交互作用在慢性乙肝病毒抗原血清轉(zhuǎn)化中的意義提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：
　　 1研究對(duì)象選擇:選擇10例未進(jìn)行抗HBV-DNA病毒治療的HBeAg+的慢性乙型肝炎患者為研究

15、對(duì)象。
　　 2標(biāo)本制備與處理:磁珠分離外周血CXCR5+細(xì)胞,以空白、IL-4、IL-10、IL21四種處理因素刺激細(xì)胞,體外培養(yǎng)一周。
　　 3流式細(xì)胞儀檢測(cè):以相應(yīng)抗體聯(lián)合活細(xì)胞熒光染料CFSE記標(biāo)細(xì)胞,檢測(cè)B細(xì)胞百分率與熒光稀釋度,反映B細(xì)胞增殖情況。
　　 4培養(yǎng)上清液檢測(cè):采用ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清液HB eAb滴度。
　　 5統(tǒng)計(jì)分析:采用spss17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù);采用Kolmog

16、orov-Smimov檢驗(yàn)檢測(cè)數(shù)據(jù)正態(tài)性,Levene檢驗(yàn)檢測(cè)方差齊性;采用單因素方差分析或秩和檢驗(yàn)檢測(cè)各組數(shù)據(jù)差異性。
　　 結(jié)果：
　　 1流式細(xì)胞鑒定CXCR5+細(xì)胞純度與百分比磁珠分離后CXCR細(xì)胞純度為68.82％±12.23%,其中CD4細(xì)胞占55.25%±17.82%,CD19細(xì)胞占36.98%±8.25%;
　　 2 CFSE標(biāo)記細(xì)胞觀察B淋巴細(xì)胞增值體外培養(yǎng)慢性乙型肝炎患者來(lái)源的CXCR5+細(xì)胞

17、7天,流式細(xì)胞儀檢測(cè)B細(xì)胞組成:培養(yǎng)前B細(xì)胞百分率為32.21%±6.82%,經(jīng)不同細(xì)胞因子刺激培養(yǎng)7天后,空白對(duì)照組為:37.71%±8.21%,IL-4刺激組為:48.22%/±9.17%;IL-10刺激組為:40.21%±6.62%;IL-21刺激組為54.35±6.38%;經(jīng)方差分析后顯示;與培養(yǎng)前比較,培養(yǎng)7天后各組細(xì)胞均出現(xiàn)明顯增值(P＜0.05);而較未刺激組相比,IL-4與IL-21刺激組B細(xì)胞增值最為明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)

18、學(xué)意義(P＜0.05);
　　 3 ELISA檢測(cè)培養(yǎng)上清液HB e Ab定量不同細(xì)胞因子刺激培養(yǎng)一周后,采用ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清液中HB e Ab水平,其中IL-21刺激組產(chǎn)生水平明顯高于其它組,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),平均濃度為0.729±0.132 pg/ml,空白對(duì)照組,IL-4刺激組與IL-10刺激組分別為0.429±0.128 pg/ml,0.415±0.114 pg/ml,0.468±0.135 p

19、g/ml;三組分別的抗體量無(wú)明顯差別,數(shù)據(jù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);
　　 結(jié)論：
　　 1磁珠分離可以分離獲得較高純度的CXCR5+細(xì)胞,CXCR5細(xì)胞主要由B細(xì)胞,Tfh細(xì)胞組成,還包括少量的其它細(xì)胞,如DC,CD8+T淋巴細(xì)胞等;
　　 2在Tfh細(xì)胞提供的CD40L,ICOS等信號(hào)背景下,IL-21與IL-4可顯著刺激B淋巴細(xì)胞增殖,其作用強(qiáng)于IL-10,有利于提高機(jī)體體液免疫應(yīng)答;
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