大蒜素聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)HCT-8細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及機(jī)制探討.pdf

1、背景與目的:隨著人們生活方式和膳食結(jié)構(gòu)的改變以及人口的老齡化,大腸癌的發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)。目前大腸癌占惡性腫瘤的10％~15％,且全球大腸癌發(fā)病率仍以2％的速度遞增。在我國,近年來大腸癌發(fā)病率增加較快,尤以大城市顯著。據(jù)統(tǒng)計(jì),大于30％的病人在臨床診斷時(shí)已屬轉(zhuǎn)移性大腸癌。手術(shù)病例中早期大腸癌不足5％,大腸癌根治術(shù)后50％以上的病人在5年內(nèi)復(fù)發(fā)。對(duì)于復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性大腸癌,化療在其綜合治療中應(yīng)占重要地位。
　　奧沙利鉑是大腸癌術(shù)后輔

2、助化療及部分晚期大腸癌姑息化療的一線藥物。但是奧沙利鉑突出的累積劑量相關(guān)的毒副反應(yīng)如慢性周圍神經(jīng)毒性限制了其臨床長(zhǎng)期應(yīng)用。所以需要尋找一種能增強(qiáng)奧沙利鉑抗腫瘤作用而本身無明顯毒副作用的藥物。
　　大蒜素是從大蒜球莖提取出來的一種含硫化合物,化學(xué)名為二烯丙基三硫化物(DiallylTrisulfide,DATS),被譽(yù)為天然廣譜抗生素藥物。除抗炎作用外,大蒜素還具有抗衰老、降血脂、降血壓、抗凝血、抗病毒等作用。近年研究發(fā)現(xiàn)大蒜素對(duì)腫

3、瘤細(xì)胞具有抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡及直接殺傷腫瘤細(xì)胞等作用。研究還表明大蒜素不僅可以通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能以干擾腫瘤的生長(zhǎng)以還可以與化療藥物合用起到化療增敏作用。國內(nèi)外有大蒜素聯(lián)合紫杉醇、長(zhǎng)春新堿或順鉑作用于宮頸癌、前列腺癌、食管癌及胃癌等細(xì)胞的報(bào)道,但大蒜素與奧沙利鉑聯(lián)合作用于大腸癌的報(bào)道鮮見。
　　為研究大蒜素與奧沙利鉑單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大腸癌HCT-8細(xì)胞增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響并初步探討其機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)把大蒜素

4、和奧沙利鉑單獨(dú)及聯(lián)合作用于HCT-8細(xì)胞,通過MTT法及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了兩藥單用及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)HCT-8細(xì)胞的分裂增殖、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響,進(jìn)一步通過免疫細(xì)胞化學(xué)方法從蛋白分子水平檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。這為臨床聯(lián)合應(yīng)用大蒜素與奧沙利鉑以減少奧沙利鉑的應(yīng)用劑量并進(jìn)而減少其累積劑量相關(guān)性毒副反應(yīng)的發(fā)生率、提高腫瘤細(xì)胞對(duì)奧沙利鉑的敏感性提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　材料與方法:1.細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)。常規(guī)復(fù)蘇凍存的HCT-8細(xì)胞,培養(yǎng)在含有10％標(biāo)

5、準(zhǔn)胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中,于37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)。每2-3天消化傳代。2.MTT法檢測(cè)不同濃度的大蒜素、奧沙利鉑對(duì)HCT-8細(xì)胞24、48、72h的增殖抑制率(IR)、并計(jì)算各藥物對(duì)HCT-8細(xì)胞24h的半數(shù)抑制濃度IC50。藥物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率:IR(％)=(1-實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組平均OD值)×100％。3.MTT法檢測(cè)大蒜素聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)HCT-8細(xì)胞的增殖抑制作用。分組為大蒜素組、奧沙利鉑組、聯(lián)

6、合用藥組、對(duì)照組和調(diào)零組,作用時(shí)間為24h。4.倒置顯微鏡下觀察藥物作用前及作用24、48、72h后細(xì)胞形態(tài)的變化。5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡。HCT-8細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,使細(xì)胞生長(zhǎng)同步化,之后常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞貼滿瓶底70％時(shí)分組:大蒜素組、奧沙利鉑組、聯(lián)合用藥組和對(duì)照組。處理因素作用24h后終止。各組細(xì)胞收集后取一部分及時(shí)上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡,另一部分經(jīng)冰乙醇固定過夜后上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞周期。6.免疫組化法檢測(cè)caspas

7、e-3的表達(dá)。取對(duì)數(shù)生期的HCT-8細(xì)胞,加入已放置蓋玻片的24孔板中,細(xì)胞貼滿瓶底70％時(shí)分組處理。分組處理及作用時(shí)間同凋亡檢測(cè)。采用免疫細(xì)胞化學(xué)SP法DAB檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)caspase-3的表達(dá)。結(jié)果判定:caspase-3陽性細(xì)胞胞漿/胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒,以胞漿為主。
　　結(jié)果:1.大蒜素和奧沙利鉑單獨(dú)作用于HCT-8細(xì)胞后,與對(duì)照組比較,增殖抑制率均升高(均為P<0.01),并且大蒜素和奧沙利鉑對(duì)HCT-8細(xì)胞的增殖抑制作用

8、隨藥物濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。2.大蒜素和奧沙利鉑對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的協(xié)同抑制效應(yīng)。聯(lián)合用藥組的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率較各單藥組明顯增加,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01),兩藥合用表現(xiàn)為協(xié)同作用:q=1.27,P<0.05。3.對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好,呈不規(guī)則多角形,隨時(shí)間推移,細(xì)胞數(shù)目漸增多。大蒜素組和奧沙利鉑組細(xì)胞,隨藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞數(shù)目逐漸減少,體積縮小,形狀變圓,部分胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡,可見有懸浮細(xì)胞。聯(lián)合用藥組,上述變化

9、更明顯,懸浮細(xì)胞明顯增多。4.大蒜素和奧沙利鉑對(duì)細(xì)胞周期的影響。大蒜素誘導(dǎo)HCT-8細(xì)胞24h后,細(xì)胞周期發(fā)生了明顯變化。和對(duì)照組比較,大蒜素組和聯(lián)合用藥組的G0/G1期細(xì)胞減少,G2/M期細(xì)胞增加(均為P<0.01),而S期細(xì)胞無明顯變化(均為P>0.05);奧沙利鉑組各周期與對(duì)照組比較無明顯變化(均為P>0.05)。5.大蒜素和奧沙利鉑對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。藥物作用24h后,與對(duì)照組比較,大蒜素組、奧沙利鉑組及聯(lián)合用藥組的凋亡率均增加(

10、P<0.01);與奧沙利鉑組、大蒜素組分別比較,聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率明顯增高(均為P<0.01)。6.caspase-3的陽性表達(dá)率。處理因素作用24h后,與對(duì)照組比較,大蒜素和奧沙利鉑各單藥組及聯(lián)合用藥組caspase-3陽性表達(dá)率均增加(P<0.01);與各單藥組比較,聯(lián)合用藥組caspase-3陽性表達(dá)率均增加(P<0.01)。
　　結(jié)論:1.大蒜素對(duì)大腸癌細(xì)胞系HCT-8細(xì)胞具有增殖抑制作用。2.大蒜素和奧沙利鉑聯(lián)合應(yīng)用對(duì)