人結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)EGFR抑制劑敏感性的觀察及其耐受機(jī)制的探討.pdf

1、第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文人結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)EGFR抑制劑敏感性的觀察及其耐受機(jī)制的探討姓名：楊黎申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師：梁后杰20080501第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文區(qū)域自動(dòng)磷酸化，為細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)蛋白提供磷酸結(jié)合位點(diǎn)，從而激活細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路的連鎖級(jí)聯(lián)效應(yīng)( 主要是P 1 3 ⅪA k t 通路和R a s ／R a f ／M A P K 通路) ，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和抑制凋亡。吉非替尼與A T P 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合E G F R

2、 細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶域，阻止受體磷酸化，抑制E G F R 激活的多條信號(hào)通路。然而目前越來越多的研究表明E G F R 下游信號(hào)通路中的蛋白持續(xù)性活化，不被吉非替尼所抑制，導(dǎo)致細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖，進(jìn)而引起腫瘤抗拒吉非替尼作用，本研究觀察6 種結(jié)腸癌細(xì)胞株在體外對(duì)吉非替尼的敏感性，分析E G F R 和下游信號(hào)通路蛋白的基礎(chǔ)( b a s e l i n e ) 表達(dá)及其活性與吉非替尼敏感性的關(guān)系；檢測(cè)吉非替尼作用下敏感性不同的細(xì)胞E G

3、F R 和下游信號(hào)通路的活化狀態(tài)；觀察與E G F R 相關(guān)的I G F R —l 和M E T 的表達(dá)及其活性與吉非替尼敏感性的關(guān)系；探討結(jié)腸癌細(xì)胞耐受吉非替尼的機(jī)制并以此進(jìn)行逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐受表型的研究。方法l 、應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)和R T - P C R 分別檢測(cè)6 種結(jié)腸癌細(xì)胞中E G F R 蛋白和m R N A的表達(dá)。2 、體外藥物敏感性實(shí)驗(yàn)( M T T 法) 觀察在有或無E G F R 的配體一表皮生長(zhǎng)因子( e p i d e

4、 r m a lg r o w t hf a c t o r ，E G F ) 刺激狀態(tài)下吉非替尼對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率，并計(jì)算出半量抑制濃度( 5 0 ％i n h i b i t i o n c o n c e n t r a t i o n ，I c 5 0 ) 。3 、以W e s t e r n b l o t 檢測(cè)E G F R 和下游信號(hào)通路蛋白的基礎(chǔ)表達(dá)及其活性，以及在吉非替尼作用下各蛋白的表達(dá)及其活化狀態(tài)。4 、應(yīng)用

5、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)吉非替尼對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞周期和凋亡的影響。5 、以W e s t e m b l o t 檢測(cè)與E G F R 相關(guān)的其他酪氨酸激酶受體I G F R 一1 和M E T 的基礎(chǔ)表達(dá)及其活性，以及在吉非替尼作用下的表達(dá)和活化狀態(tài)，以I m P C R 檢測(cè)相應(yīng)配體的m R N A 表達(dá)。6 、采用相應(yīng)的受體酪氨酸激酶抑制劑阻斷I G F R 一1 或M E T 活性，以W e s t e m b l o t檢測(cè)與E G F R

6、 共同的下游信號(hào)通路的活化狀態(tài)。7 、以免疫共沉淀法和w e s t e m b l o t 檢測(cè)受體之間的相互作用以及受體與下游信號(hào)通路蛋白的作用。8 、進(jìn)行逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐受表型的研究，通過M T T 法和流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)生長(zhǎng)抑制效應(yīng)。9 、以W e s t e m b l o t 檢測(cè)A K T 和M A P K 共同的下游信號(hào)蛋白激酶一糖原合成酶激酶3 p ( 9 1 y c o g e n s y n t h e s e s k i