重癥急性胰腺炎早期大鼠腸道黏膜屏障功能的改變及其與Occludin蛋白的相關(guān)性研究.pdf

1、重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)是一種發(fā)病急、病情進(jìn)展快、并發(fā)癥多,并伴有極高死亡率的嚴(yán)重疾病,是臨床常見(jiàn)急腹癥之一。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前對(duì)其研究尚不清楚,治療缺乏有效的方法。 SAP后期發(fā)生的壞死胰腺組織感染及其并發(fā)的多器官功能衰竭是SAP最重要的并發(fā)癥,是目前引起SAP高死亡率的一個(gè)重要原因。已有的研究表明,引起SAP后期胰腺感染的關(guān)鍵誘因是腸道黏膜屏障功能損傷所致的腸道菌群易位。

2、正常情況下,腸管具有完整的屏障功能,使腸內(nèi)的細(xì)菌和內(nèi)毒素等物質(zhì)被局限于腸腔內(nèi)而不會(huì)轉(zhuǎn)移到外周臟器。SAP發(fā)生后,由于腸道血供急劇下降,腸管發(fā)生缺血和低灌流狀態(tài),使對(duì)血流量高度敏感的腸黏膜屏障首先受損。腸內(nèi)免疫物質(zhì)分泌減少,腸粘膜上皮細(xì)胞及細(xì)胞間緊密連接被破壞,其結(jié)局是致病菌可能經(jīng)受損腸黏膜屏障進(jìn)入腸系膜淋巴結(jié)、門靜脈、胰腺及遠(yuǎn)處臟器,引發(fā)敗血癥和全身多臟器感染,進(jìn)一步加重了SAP的發(fā)展。因此,改善腸道的屏障功能可能是預(yù)防或改善SAP應(yīng)激

3、誘導(dǎo)的腸道功能障礙的新對(duì)策,如何維護(hù)SAP患者的腸屏障功能預(yù)防后期感染的發(fā)生是目前臨床研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)問(wèn)題。 腸上皮細(xì)胞間的緊密連接與腸上皮細(xì)胞共同參與構(gòu)成了腸粘膜屏障,其能夠有效的阻止腸腔內(nèi)分子量大于200Da的顆粒及某些親水性分子通過(guò)腸上皮層。而Occludin蛋白是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的高表達(dá)于腸上皮細(xì)胞的重要蛋白,它是細(xì)胞間緊密連接的主要成分。有學(xué)者觀察到在大鼠SAP早期即存在細(xì)胞緊密連接開(kāi)放。但目前對(duì)于早期Occludin變化規(guī)

4、律及其在調(diào)節(jié)細(xì)胞緊密連接功能上的作用的認(rèn)識(shí)尚不十分清楚。因此,我們?cè)O(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)以初步探索SAP大鼠早期腸道粘膜屏障功能的變化及其與Occludin蛋白的相關(guān)性,以期為將來(lái)的臨床診療提供有效的靶點(diǎn)。 本實(shí)驗(yàn)選用SD大鼠構(gòu)建SAP動(dòng)物模型,采用DAO、TUNEL等方法觀察SAP早期腸道通透性、腸道上皮凋亡的改變以評(píng)價(jià)SAP發(fā)病早期(48h內(nèi))腸道屏障功能的變化情況。進(jìn)而通過(guò)免疫組化、rt-PCR和Western Blotting等方

5、法檢測(cè)腸道Occludin表達(dá)的變化以初步探索其在SAP早期腸道粘膜屏障功能障礙中的作用,為臨床治療提供參考。全研究分為3個(gè)部分進(jìn)行： 第一部分 SAP大鼠動(dòng)物模型的建立 目的：通過(guò)逆行胰膽管注射制備大鼠重癥急性胰腺炎模型,并評(píng)價(jià)模型的穩(wěn)定性。 方法：將42只SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組(18只)和SAP組(24只),每組等分為12h、24h、48h 3個(gè)亞組,采用胰管內(nèi)逆行注射5％?；悄懰徕c的方法制作動(dòng)物模型。造模

6、完成后通這血清淀粉酶檢測(cè)以及胰腺病理學(xué)HE染色評(píng)價(jià)模型。 結(jié)果：內(nèi)眼觀察對(duì)照組腹腔沒(méi)有明顯改變,SAP大鼠腹腔可見(jiàn)擴(kuò)張的腸管,腸間隙可見(jiàn)游離腹水,胰腺組織液化、出血等。胰腺病理HE染色顯示,對(duì)照組小葉結(jié)構(gòu)清晰,SAP胰腺組織小葉結(jié)構(gòu)模糊,部分腺泡細(xì)胞壞死,間質(zhì)充血,纖維組織增生,并隨著時(shí)間進(jìn)展而漸進(jìn)性加重。其病理學(xué)評(píng)分證實(shí)SAP組胰腺病理改變顯著重于同時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)對(duì)照組,兩者有顯著性差異(假手術(shù)組1.08±0.66,SAP組12

7、.33±0.93,P<0.01)。血清淀粉酶結(jié)果顯示,SAP組12h升高,24h后達(dá)到高峰,48h仍維持在很高的水平,與假手術(shù)組大鼠相比有顯著差異(假手術(shù)組2676±230u/l,SAP組9408±1256u/l,P<0.01)。 結(jié)論：胰管內(nèi)逆行注射5％?；悄懰徕c可成功誘導(dǎo)的大鼠SAP動(dòng)物模型。模型誘發(fā)成功后胰腺炎病情呈漸進(jìn)性發(fā)展且重復(fù)性及可比性好,適合SAP的發(fā)病機(jī)制和治療學(xué)的研究。 第二部分 SAP早期腸道黏膜屏障

8、功能的變化及其機(jī)制研究 目的：構(gòu)建SAP大鼠模型,觀察SAP發(fā)病早期腸道黏膜屏障功能的變化情況。 方法：將36只SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組和SAP組,每組等分為12h、24h、48h 3個(gè)亞組,同第一部分制備SAP大鼠模型。分別于造模后12h、24h、48h留取血、胰腺、小腸組織,通過(guò)HE染色觀察胰腺、小腸的病理變化,血清DAO檢測(cè)以評(píng)價(jià)腸黏膜的通透性,Tunel法檢測(cè)上皮細(xì)胞的凋亡。 結(jié)果：病理HE染色提示SAP

9、12h腸黏膜結(jié)構(gòu)形態(tài)大致正常、24h出現(xiàn)腸壁充血、水腫、伴少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),而48h上述改變更加明顯。血清DAO結(jié)果顯示24h明顯升高,與對(duì)照組相比有顯著差異(SAP組為1.22±0.26,假手術(shù)組0.26±0.05,p<0.01)。腸上皮原位凋亡檢測(cè)結(jié)果,SAP組48h腸上皮凋亡較對(duì)照組明顯增加,分別為(SAP組63.3±6.1,假手術(shù)組8.3±1.8,p<0.01)。 結(jié)論:SAP早期隨著腸道病理改變加重,腸道上皮細(xì)胞凋亡逐

10、漸增加,并伴有腸道通透性增加等功能改變。 第三部分 SAP早期腸上皮細(xì)胞間緊密結(jié)合蛋白o(hù)ccludin的變化研究 目的：觀察SAP早期大鼠腸道上皮閉鎖蛋白Occludin的蛋白及mRNA表達(dá)變化,并分析其與病情的相關(guān)性。 方法：由第二部分中留取的小腸組織,采用免疫組化、rt-PCR、western-blot等方法觀察比較假手術(shù)組和SAP組小腸上皮Occludin蛋白及mRNA的表達(dá)差異。 結(jié)果：①免疫組化

11、結(jié)果顯示SAP組Occludin表達(dá)較對(duì)照組明顯降低,并隨著病程的進(jìn)展呈持續(xù)下降的趨勢(shì)。與胰腺病理變化存在明顯相關(guān)性。②rt-PCR結(jié)果顯示大鼠腸道高表達(dá)occludin mRNA,SAP組12h無(wú)明顯變化,但隨病情進(jìn)展,至24h開(kāi)始下降,48h下降明顯。③western blot半定量免疫印跡分析顯示在65KD處大鼠各組小腸均表達(dá)Occludin蛋白,SAP組12h變化不明顯,24h表現(xiàn)出下降趨勢(shì),至48h明顯低于對(duì)照組,并隨著病程的