重癥急性胰腺炎早期大鼠腸道黏膜屏障功能的改變及其與Occludin蛋白的相關性研究.pdf

1、重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)是一種發(fā)病急、病情進展快、并發(fā)癥多,并伴有極高死亡率的嚴重疾病,是臨床常見急腹癥之一。其發(fā)病機制復雜,目前對其研究尚不清楚,治療缺乏有效的方法。 SAP后期發(fā)生的壞死胰腺組織感染及其并發(fā)的多器官功能衰竭是SAP最重要的并發(fā)癥,是目前引起SAP高死亡率的一個重要原因。已有的研究表明,引起SAP后期胰腺感染的關鍵誘因是腸道黏膜屏障功能損傷所致的腸道菌群易位。

2、正常情況下,腸管具有完整的屏障功能,使腸內(nèi)的細菌和內(nèi)毒素等物質(zhì)被局限于腸腔內(nèi)而不會轉移到外周臟器。SAP發(fā)生后,由于腸道血供急劇下降,腸管發(fā)生缺血和低灌流狀態(tài),使對血流量高度敏感的腸黏膜屏障首先受損。腸內(nèi)免疫物質(zhì)分泌減少,腸粘膜上皮細胞及細胞間緊密連接被破壞,其結局是致病菌可能經(jīng)受損腸黏膜屏障進入腸系膜淋巴結、門靜脈、胰腺及遠處臟器,引發(fā)敗血癥和全身多臟器感染,進一步加重了SAP的發(fā)展。因此,改善腸道的屏障功能可能是預防或改善SAP應激

3、誘導的腸道功能障礙的新對策,如何維護SAP患者的腸屏障功能預防后期感染的發(fā)生是目前臨床研究的重點和熱點問題。 腸上皮細胞間的緊密連接與腸上皮細胞共同參與構成了腸粘膜屏障,其能夠有效的阻止腸腔內(nèi)分子量大于200Da的顆粒及某些親水性分子通過腸上皮層。而Occludin蛋白是近年來發(fā)現(xiàn)的高表達于腸上皮細胞的重要蛋白,它是細胞間緊密連接的主要成分。有學者觀察到在大鼠SAP早期即存在細胞緊密連接開放。但目前對于早期Occludin變化規(guī)

4、律及其在調(diào)節(jié)細胞緊密連接功能上的作用的認識尚不十分清楚。因此,我們設計了本實驗以初步探索SAP大鼠早期腸道粘膜屏障功能的變化及其與Occludin蛋白的相關性,以期為將來的臨床診療提供有效的靶點。 本實驗選用SD大鼠構建SAP動物模型,采用DAO、TUNEL等方法觀察SAP早期腸道通透性、腸道上皮凋亡的改變以評價SAP發(fā)病早期(48h內(nèi))腸道屏障功能的變化情況。進而通過免疫組化、rt-PCR和Western Blotting等方

5、法檢測腸道Occludin表達的變化以初步探索其在SAP早期腸道粘膜屏障功能障礙中的作用,為臨床治療提供參考。全研究分為3個部分進行： 第一部分 SAP大鼠動物模型的建立 目的：通過逆行胰膽管注射制備大鼠重癥急性胰腺炎模型,并評價模型的穩(wěn)定性。 方法：將42只SD大鼠隨機分成假手術組(18只)和SAP組(24只),每組等分為12h、24h、48h 3個亞組,采用胰管內(nèi)逆行注射5％牛磺膽酸鈉的方法制作動物模型。造模

6、完成后通這血清淀粉酶檢測以及胰腺病理學HE染色評價模型。 結果：內(nèi)眼觀察對照組腹腔沒有明顯改變,SAP大鼠腹腔可見擴張的腸管,腸間隙可見游離腹水,胰腺組織液化、出血等。胰腺病理HE染色顯示,對照組小葉結構清晰,SAP胰腺組織小葉結構模糊,部分腺泡細胞壞死,間質(zhì)充血,纖維組織增生,并隨著時間進展而漸進性加重。其病理學評分證實SAP組胰腺病理改變顯著重于同時間點假手術對照組,兩者有顯著性差異(假手術組1.08±0.66,SAP組12

7、.33±0.93,P<0.01)。血清淀粉酶結果顯示,SAP組12h升高,24h后達到高峰,48h仍維持在很高的水平,與假手術組大鼠相比有顯著差異(假手術組2676±230u/l,SAP組9408±1256u/l,P<0.01)。 結論：胰管內(nèi)逆行注射5％牛磺膽酸鈉可成功誘導的大鼠SAP動物模型。模型誘發(fā)成功后胰腺炎病情呈漸進性發(fā)展且重復性及可比性好,適合SAP的發(fā)病機制和治療學的研究。 第二部分 SAP早期腸道黏膜屏障

8、功能的變化及其機制研究 目的：構建SAP大鼠模型,觀察SAP發(fā)病早期腸道黏膜屏障功能的變化情況。 方法：將36只SD大鼠隨機分成假手術組和SAP組,每組等分為12h、24h、48h 3個亞組,同第一部分制備SAP大鼠模型。分別于造模后12h、24h、48h留取血、胰腺、小腸組織,通過HE染色觀察胰腺、小腸的病理變化,血清DAO檢測以評價腸黏膜的通透性,Tunel法檢測上皮細胞的凋亡。 結果：病理HE染色提示SAP

9、12h腸黏膜結構形態(tài)大致正常、24h出現(xiàn)腸壁充血、水腫、伴少量炎癥細胞浸潤,而48h上述改變更加明顯。血清DAO結果顯示24h明顯升高,與對照組相比有顯著差異(SAP組為1.22±0.26,假手術組0.26±0.05,p<0.01)。腸上皮原位凋亡檢測結果,SAP組48h腸上皮凋亡較對照組明顯增加,分別為(SAP組63.3±6.1,假手術組8.3±1.8,p<0.01)。 結論:SAP早期隨著腸道病理改變加重,腸道上皮細胞凋亡逐

10、漸增加,并伴有腸道通透性增加等功能改變。 第三部分 SAP早期腸上皮細胞間緊密結合蛋白occludin的變化研究 目的：觀察SAP早期大鼠腸道上皮閉鎖蛋白Occludin的蛋白及mRNA表達變化,并分析其與病情的相關性。 方法：由第二部分中留取的小腸組織,采用免疫組化、rt-PCR、western-blot等方法觀察比較假手術組和SAP組小腸上皮Occludin蛋白及mRNA的表達差異。 結果：①免疫組化

11、結果顯示SAP組Occludin表達較對照組明顯降低,并隨著病程的進展呈持續(xù)下降的趨勢。與胰腺病理變化存在明顯相關性。②rt-PCR結果顯示大鼠腸道高表達occludin mRNA,SAP組12h無明顯變化,但隨病情進展,至24h開始下降,48h下降明顯。③western blot半定量免疫印跡分析顯示在65KD處大鼠各組小腸均表達Occludin蛋白,SAP組12h變化不明顯,24h表現(xiàn)出下降趨勢,至48h明顯低于對照組,并隨著病程的