利用孕婦血漿游離胎兒DNA行胎兒產(chǎn)前診斷的研究.pdf

1、1997年，Lo等利用普通聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)在孕男胎的孕婦血漿中檢測(cè)到Y(jié)染色體性別決定基因(sex-determiningregionYgene，SRY)的特異性序列，確定了孕婦血漿中存在游離胎兒DNA(fetalDNA，fDNA)。此后進(jìn)行了一系列利用fDNA進(jìn)行性連鎖遺傳性疾病、RhD血型、妊娠并發(fā)癥和21三體綜合征等產(chǎn)前診斷的研究，其中RhD血型的產(chǎn)前診斷是歐洲首個(gè)臨床開(kāi)展的以DNA為基礎(chǔ)的無(wú)創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷常規(guī)項(xiàng)目。目前，

2、fDNA已經(jīng)成為無(wú)創(chuàng)傷性產(chǎn)前遺傳病基因診斷的重要物質(zhì)來(lái)源，為無(wú)創(chuàng)傷性產(chǎn)前診斷開(kāi)辟了新的途徑。 妊娠過(guò)程中，孕婦免疫系統(tǒng)接觸胎兒血細(xì)胞抗原(紅細(xì)胞、血小板)，胎兒血細(xì)胞可刺激孕母產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，引起新生兒溶血病(haemoliticdiseaseofthenewborn，HDN)和新生兒同種免疫性血小板減少性紫癜(neonatalalloimmuethrombocytopenicpurpura，NAITP)等嚴(yán)重并發(fā)癥，產(chǎn)前獲取胎

3、兒遺傳物質(zhì)進(jìn)行基因診斷是行之有效的預(yù)防方法。本研究利用孕婦血漿中的fDNA進(jìn)行了產(chǎn)前胎兒紅細(xì)胞RhEe抗原和人類血小板抗原(humanplateletantigen，HPA)的基因診斷，具有一定的創(chuàng)新性和臨床意義。 在第一部分實(shí)驗(yàn)中，以胎兒SRY基因?yàn)榘行蛄?，建立了改良的?氯仿法從孕婦血漿中提取DNA，采用巢式PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序鑒定。與隨訪結(jié)果相比，30例孕婦的診斷準(zhǔn)確性達(dá)93.3﹪，可應(yīng)用于無(wú)創(chuàng)傷性產(chǎn)前性連鎖

4、遺傳性疾病的診斷。 第二部分實(shí)驗(yàn)的目的是利用孕婦血漿fDNA鑒定胎兒紅細(xì)胞RhEe血型的基因型。首先通過(guò)普通PCR擴(kuò)增SRY基因以確認(rèn)fDNA的存在，然后采用PCR-序列特異性引物(PCR-SSP)方法擴(kuò)增12例孕婦血漿中fDNA，以檢測(cè)胎兒RhEe血型抗原的基因表型，并對(duì)產(chǎn)前孕婦外周血和產(chǎn)后嬰兒外周血進(jìn)行RhEe血清學(xué)分型，回顧性評(píng)價(jià)胎兒基因分型結(jié)果的準(zhǔn)確性。結(jié)果證實(shí)本研究建立的無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷胎兒RhEe血型抗原的基因型方法是

5、可行的，當(dāng)母親RhEe表型為純合子時(shí)，對(duì)血漿中胎兒RhEe行基因分型具有臨床意義。 在第三部分實(shí)驗(yàn)中，建立了HPA-1～6、Gov系統(tǒng)的同步基因分型技術(shù)，以了解中國(guó)人群中HPA的基因分布情況。共設(shè)計(jì)合成21對(duì)序列特異性引物，探索最佳退火溫度，使HPA-1～6和Gov系統(tǒng)等位基因在同一條件下進(jìn)行同步擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在同一凝膠中進(jìn)行同步電泳。此方法進(jìn)行HPA基因分型準(zhǔn)確率可以達(dá)到100﹪，中國(guó)人群中Gov(HPA-15)抗原系統(tǒng)在臨床

6、上的意義較大。 第四部分實(shí)驗(yàn)中，在第一、二、三部分實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)上，首次對(duì)孕婦血漿fDNA鑒定胎兒Gov基因型進(jìn)行初步研究。從孕婦血漿中提取DNA后，對(duì)胎兒Gov基因進(jìn)行PCR-SSP基因分型，并對(duì)產(chǎn)前孕婦外周血和產(chǎn)后嬰兒外周血進(jìn)行Gov基因PCR-SSP基因分型，回顧性評(píng)價(jià)胎兒基因分型結(jié)果的準(zhǔn)確性。結(jié)果證實(shí)所建立的無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前診斷胎兒Gov基因型的方法是可行的，當(dāng)母親Gov基因表型為純合子時(shí)，血漿中胎兒Gov基因分型具有臨床意義