子癇前期孕婦血清中胎兒游離DNA水平的研究.pdf

1、目的： 探討孕婦血清中胎兒游離DNA水平的檢測在子癇前期病因及診斷中的應(yīng)用價值。檢測子癇前期患者血清中胎兒游離DNA的含量與正常孕婦進(jìn)行比較，有助于對子癇前期病因的研究；對輕、重度子癇前期患者血清中胎兒游離DNA水平的比較則可能有助于子癇前期病情進(jìn)展的觀察，并且可能有助于預(yù)測子癇的發(fā)生。 方法： 607例行產(chǎn)前檢查的孕婦，56例進(jìn)展為子癇前期，其中30例經(jīng)B超確定所妊娠為男性胎兒的孕婦(分娩后證實為男嬰)為子癇前

2、期組，參照第六版《婦產(chǎn)科學(xué)》妊娠期高血壓疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，輕度子癇前期組14例、重度子癇前期組16例、合并HELLP綜合征(hemolysis，elavated serum level of liverenzymes，and low platelets)10例。另選擇30例經(jīng)B超確定所妊娠為男性胎兒的正常孕婦(分娩后證實為男嬰)為對照組。10例經(jīng)B超確定所妊娠為女性胎兒的孕婦(分娩后證實為女嬰)作為陰性對照。用普通試管各抽取孕婦平均孕20

3、周、孕晚期(子癇前期組孕33周，對照組孕34周)空腹外周血3ml，離心取血清。用QIAamp DNA B100d Mini Kit提取母體血清中總的游離DNA。采用實時熒光定量PCR(FQ-PCR)方法檢測各組血清標(biāo)本中目的基因SRY(Y染色體上的性別決定基因)及內(nèi)參照β-actin基因的表達(dá)，讀取Ct值(cyclethreshold)。將子癇前期組和對照組Ct值樣本均數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，若差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，再運用2<'

4、-△△Ct>公式法進(jìn)行相對定量，2<'-△△Ct>=子癇前期組目的基因SRY相對于對照組目的基因SRY表達(dá)的倍數(shù)，即子癇前期孕婦血清中胎兒游離DNA相對于正常孕婦的倍數(shù)。 結(jié)果： 1．孕婦血清中DNA的純度： 用QIAamp DNA Blood Mini Kit抽提的孕婦外周血清中游離DNA，采用紫外分光光度計進(jìn)行純度測定，絕大多數(shù)標(biāo)本的DNA純度較高，A260/280比值在1.6～1.8之間。 2．普通

5、PCR擴(kuò)增目的基因SRY和內(nèi)參照基因β-actin的瓊脂糖電泳結(jié)果：SRY的擴(kuò)增產(chǎn)物為136bp，β-actin的擴(kuò)增產(chǎn)物為101bp，無引物二聚體，無雜帶，設(shè)計的PCR引物特異性好。 3．熒光定量PCR結(jié)果： 1)該檢測系統(tǒng)的特異性達(dá)100％，10例所妊娠為女性胎兒的孕婦血清中均未檢測到SRY基因的表達(dá)；敏感性達(dá)96.7％，60例所妊娠為男性胎兒的孕婦血清中有58例可以檢測到胎兒游離DNA。 2) 孕20周母體

6、血清中胎兒游離DNA水平的檢測： 子癇前期組和對照組樣本均數(shù)進(jìn)行兩樣本間的t檢驗，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。輕、重度子癇前期及合并HELLP綜合征的樣本均數(shù)間進(jìn)行q檢驗：輕、重度之間及輕度與合并HELLP綜合征之間，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；重度與合并HELLP綜合征的差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，可認(rèn)為重度子癇前期與合并HELLP綜合征孕婦血清中胎兒游離DNA水平無明顯差異。子癇前期組孕婦血清中胎兒游離D

7、NA為對照組的2.4倍，輕度子癇前期為對照組的1.9倍，重度為3.0倍，合并HELLP綜合征為3.1倍。 3) 孕晚期母體血清中胎兒游離DNA水平的檢測： 子癇前期組和對照組樣本均數(shù)進(jìn)行兩樣本間的t檢驗，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。輕、重度子癇前期及合并HELLP綜合征的樣本均數(shù)間進(jìn)行q檢驗：輕、重度之間，輕度與合并HELLP綜合征之間，重度與合并HELLP綜合征之間，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。子癇前期組

8、孕婦血清中胎兒游離DNA為對照組的4.5倍，輕度子癇前期為對照組的3.8倍，重度為5.5倍，合并HELLP綜合征為6.5倍。 結(jié)論 孕婦血清中存在胎兒游離DNA。子癇前期孕婦胎兒游離DNA水平明顯高于同孕周的正常孕婦，且子癇前期程度越重，胎兒游離DNA升高越明顯，這種的變化在孕20周即可查到。因此，孕婦血清中胎兒游離DNA水平的變化，可以作為觀察子癇前期病情進(jìn)展和預(yù)測子癇發(fā)生的指標(biāo)并且有助于探討子癇前期的病因、發(fā)病機(jī)制