原發(fā)性肝癌兩階段全基因組關(guān)聯(lián)試點(diǎn)研究.pdf

1、背景：原發(fā)性肝癌是常見惡性腫瘤之一，在惡性腫瘤中其世界范圍年發(fā)病率占第五位，死亡率占第三位。中國是乙型肝炎病毒慢性感染大國，也是肝癌的發(fā)病大國，每年新發(fā)肝癌病例的一半來自是中國。慢性乙型肝炎病毒感染是肝癌的最重要風(fēng)險(xiǎn)因子。但是，只有少部分慢性乙型肝炎感染者最終會發(fā)生肝癌，說明遺傳背景起到重要作用。
　　方法：本研究收集中國華東地區(qū)漢族男性乙型肝炎病毒慢性感染者(HBsAg陽性)，采用病例對照研究設(shè)計(jì)，利用基因芯片進(jìn)行兩個(gè)階段的全基

2、因組單核苷酸多態(tài)性(SNP)關(guān)聯(lián)研究(genome-Wide association study，GWAS)。第一階段用Affymetrix500K基因芯片對50例肝癌和50例對照進(jìn)行全基因組50萬個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)掃描。第二階段從第一階段結(jié)果中選擇1152個(gè)SNP，利用Illumina公司GoldenGate定制基因芯片，在282個(gè)肝癌與278個(gè)對照中進(jìn)行SNP掃描和關(guān)聯(lián)分析。使用假陽性報(bào)告率(false positive r

3、eport probability，F(xiàn)PRP)對統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果進(jìn)行評估。對可能的相關(guān)基因在肝癌和癌旁組織及正常肝組織中的基因和蛋白質(zhì)表達(dá)用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)和免疫組化進(jìn)行檢測。
　　結(jié)果：第一階段SNP關(guān)聯(lián)分析顯示357個(gè)SNP的最小p值(從allel_P，genotype_P和Cochran-Armitage-P中確定)小于1×10-3。第二階段研究顯示26個(gè)SNP的等位基因分布差異的未校正p值小于0.05。第

4、一階段和第二階段合并分析顯示，8個(gè)SNP(rs2120243，rs1350171，rs7116140，rs10448338，rs4480667，rs4417097，rs9893681 and rs4561519)通過FPRP檢驗(yàn)門檻(FPRP<0.20)。關(guān)聯(lián)性最強(qiáng)的是rs2120243(合并ORallele=1.76，95％CI：1.39-2.22，p=2.00×10-6)，此SNP位于VEPH1第四內(nèi)含子中。關(guān)聯(lián)性排在第二位的是位于

5、基因FZD4下游的rs1350171(合并ORakkeke=1.66，95％CI：1.33-2.07，p=6.48×10-6)。關(guān)聯(lián)性排在第三位的是位于基因PCDH9上游的rs4480667(合并ORallele=0.64，95％CI：0.51-0.81，p=1.42×10-4)。另外SNP涉及的基因是PPMT6，LHX1和KIF2B。實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)和免疫組化染色顯示VEPH1，F(xiàn)ZD4基因的mRNA和蛋白質(zhì)在

6、肝癌組織中較癌旁組織及正常肝組織低表達(dá)，PCDH9蛋白在肝癌組織中較癌旁組織及正常肝組織顯著低表達(dá)。
　　結(jié)論：本兩個(gè)階段的全基因組關(guān)聯(lián)試點(diǎn)研究(332例肝癌和328例對照)和初步的基因表達(dá)研究，發(fā)現(xiàn)了一些肝癌相關(guān)基因?；蚬δ芊诸惡偷鞍踪|(zhì)網(wǎng)絡(luò)分析提示可能與肝癌的發(fā)生相關(guān)相關(guān)基因涉及TGFB1，PI3K/insulin，Wnt，EGFR等多條信號通路。本研究得到的關(guān)聯(lián)結(jié)果需要在具有不同遺傳背景的、更大的樣本人群中重復(fù)證實(shí)，相關(guān)基因

7、在肝癌發(fā)生中的作用需要更加深入細(xì)致的研究。
　　第一部分：第一階段全基因組關(guān)聯(lián)研究
　　本研究利用全基因組高密度SNP芯片(Affymetrix500K)在肝癌易感人群-漢族男性慢性乙型肝炎病毒感染者(HBsAg陽性)中進(jìn)行全基因組SNP掃描，在病例-對照組中發(fā)現(xiàn)SNP頻率的分布差異，進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究，旨在發(fā)現(xiàn)與肝癌發(fā)生可能有關(guān)的SNP，從中挑選通過適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計(jì)學(xué)差異門檻的SNP，進(jìn)行第二階段的擴(kuò)大樣本的SNP驗(yàn)證。
　　本

8、研究樣本50例肝癌和50例對照均為來自江蘇啟東地區(qū)的男性漢族人，血清HBsAg陽性。全基因組關(guān)聯(lián)研究結(jié)果顯示，357個(gè)SNP的分布差異最小P值(從等位基因P，基因型P和趨勢P中確定)小于1×10-3，其中26個(gè)SNP的最小P值小于1×10-4。
　　第二部分：第二階段Illumina定制芯片基因關(guān)聯(lián)研究
　　本研究利用Illumina GoldenGate客戶定制芯片對1152個(gè)SNP進(jìn)行擴(kuò)大樣本的基因關(guān)聯(lián)研究，以期驗(yàn)證第一

9、階段的關(guān)聯(lián)結(jié)果。我們依照P值大小、信號成簇性、涉及基因的對蛋白質(zhì)功能有影響錯(cuò)義突變及可能存在拷貝數(shù)變異(copy numbervariation，CNV)的挑選方法，挑選出1152個(gè)SNP進(jìn)行第二階段的驗(yàn)證工作。研究樣本包括282例肝癌和278例對照。病例來自華東地區(qū)，HBsAg陽性。對照來自江蘇啟東地區(qū)。所有研究樣本均為漢族男性人。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示643個(gè)SNP通過質(zhì)量檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)(MAF>0.01 and HWE disequi

10、libriumP>0.001，call frequency>0.95)。其中26個(gè)SNP的等位基因頻率分布差異P值小于0.05。合并第一、第二階段基因型分布頻率計(jì)算等位基因分布差異，并且用假陽性報(bào)告率(false positive report probability，F(xiàn)PRP)小于0.20為標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果顯示8個(gè)SNP(rs2120243，rs1350171，rs7116140，rs1048338，rs4480667，rs4417097，

11、rs9893681 and rs4561519)達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與8個(gè)SNP最近的6個(gè)基因是：VEPH1，F(xiàn)ZD4，PCDH9，PRMT6，LHX1和KIF2B。
　　第三部分：基因表達(dá)研究及基因注釋
　　本研究利用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)對11例肝癌組織和2例正常肝組織進(jìn)行VEPHI和FZD4基因mRNA表達(dá)檢測。
　　利用免疫組化的方法對22例肝癌、癌旁組織和11例正常肝組織進(jìn)行VEPHI，F(xiàn)ZD4

12、和PCDH9蛋白表達(dá)檢測。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，VEPH1和FZD4的mRNA和蛋白質(zhì)水平在肝癌組織中較癌旁與正常肝組織低表達(dá)(PCDH9的基因mRNA檢測尚在進(jìn)行中)。VEPH1，F(xiàn)ZD4和PCDH9蛋白質(zhì)在肝癌組織中較癌旁與正常肝組織顯著低表達(dá)。
　　通過對6個(gè)相關(guān)基因及其SNP的生物信息學(xué)檢索，發(fā)現(xiàn)多數(shù)基因與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。相關(guān)SNP分別位于這些基因的內(nèi)含子，基因上下游或是對蛋白質(zhì)功能有損害的錯(cuò)義突變。這些SNP可能

13、通過影響基因表達(dá)或者損害蛋白質(zhì)功能而影響肝癌的發(fā)生，功能學(xué)影響尚需進(jìn)一步的研究證實(shí)。
　　第四部分：基因互作研究
　　本研究利用多因子降維法(multifactor dimensionality reduction，MDR)和多元Logit回歸的方法，分析肝癌的基因互作與風(fēng)險(xiǎn)因素。6個(gè)SNP(rs2120243，rs4480667，rs1350171，rs4417097，rs9893681，rs4561519)在第二階段56

14、0個(gè)樣本中的基因型分布經(jīng)過MDR分析，顯示rs4480667，rs2120243與rs1350171有相互作用，其基因型組合可以較好地區(qū)別肝癌組與對照組，可能做為肝癌分子診斷標(biāo)志物。
　　對6個(gè) SNP(rs2120243，rs4480667，rs1350171，rs4417097，rs9893681，rs4561519)和年齡，家族史，吸煙，飲酒史進(jìn)行多元logit回歸，結(jié)果顯示：肝癌家族史，rs4480667，rs212024

15、3，rs1350171，rs4561519和rs9893681是肝癌的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因子，與肝癌的發(fā)生相關(guān)。
　　第五部分：基因功能分類及蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建
　　為了盡可能挖掘與肝癌相關(guān)的基因以及基因間的相互作用，我們擴(kuò)大基因檢索范圍：納入第一階段與第二階段合并分析或第二階段顯示等位基因頻率分布差異P值小于0.05的SNP，再利用NCBI MAPI具，搜尋與SNP最近的基因。結(jié)果顯示，共有涉及71個(gè)基因的SNP等位基因頻率分布差異P值

16、小于0.05。我們將71個(gè)基因輸入MAS3.0，DAVID和STRING服務(wù)器在線分析功能分類與蛋白網(wǎng)絡(luò)。分析結(jié)果顯示涉及前腦發(fā)育，細(xì)胞遷移，細(xì)胞增殖，基因可變剪接，細(xì)胞膜蛋白，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞黏附等基因富集明顯(與全基因組基因分類比較)。STRING分析顯示位于網(wǎng)絡(luò)中心的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)有：FYN，EGFR，SRC，PTK2B，ERBB2，BDNF，IL2，PRKCQ和CCND1等蛋白，其中許多蛋白與腫瘤有關(guān)。
　　全文結(jié)論
　　本

17、研究通過同質(zhì)性較好的肝癌易感人群兩個(gè)階段的GWAS研究，發(fā)現(xiàn)了一些可能的肝癌相關(guān)基因。實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)3個(gè)基因(VEPH1，F(xiàn)ZD4和PCDH9)在肝癌組織與癌旁及正常組織中的表達(dá)存在差異。基因功能分類及蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建顯示出可能與肝癌發(fā)生的一些相關(guān)基因及基因相互作用網(wǎng)絡(luò)。關(guān)聯(lián)結(jié)果和基因功能研究需要在更大的樣本研究中重復(fù)證實(shí)。
　　創(chuàng)新點(diǎn)
　　本研究采用病例一對照研究設(shè)計(jì)，首次利用全基因組SNP檢測進(jìn)行肝癌相關(guān)基因的篩查，找到了一