槌果藤提取物對系統(tǒng)性硬化癥患者成纖維細(xì)胞增殖和Ⅰ型膠原產(chǎn)生的影響.pdf

1、進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化癥(Progressive systemic sclerosis PSS)是一種以結(jié)締組織改變?yōu)樘卣鞯淖陨砻庖咝约膊?，分為局限型和系統(tǒng)型，主要病理特點(diǎn)是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)合成增多、分解減少，大量ECM沉積在皮膚、肺、腎等組織器官，導(dǎo)致組織器官纖維化，出現(xiàn)功能障礙，其中尤以Ⅰ型膠原增多顯著。有研究發(fā)現(xiàn)，PSS患者的成纖維細(xì)胞活性增強(qiáng)，且能持續(xù)活化，分泌Ⅰ型膠原增多。近年來研究表明

2、氧化應(yīng)激參與硬皮病的發(fā)病，PSS患者的單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生O2、H2O2水平顯著高于正常人，細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平明顯增加，增高的ROS可促進(jìn)膠原等基質(zhì)基因表達(dá)，并且可誘導(dǎo)纖溶酶原抑制因子(PAI)、金屬蛋白酶組織抑制物(TIMPs)合成，減少基質(zhì)降解。 槌果藤(Capparis spinosa L．)是一種生長在炎熱干旱氣候條件下的半灌木，具祛風(fēng)除濕、止痛活血、止淤消腫等功效，在新疆省內(nèi)作為維吾爾族藥有廣泛應(yīng)用。李凡等

3、曾報(bào)道用槌果藤外敷治療局限性硬皮病有明顯療效，但未見有關(guān)藥理學(xué)及作用機(jī)制方面的研究報(bào)道。本研究用Western blot、RT-PCR、MTT、流式細(xì)胞術(shù)等手段和方法觀察槌果藤乙醇提取物對正常人及PSS患者成纖維細(xì)胞增殖、Ⅰ型膠原產(chǎn)生的影響，并進(jìn)一步探討了其抗氧化作用，為該藥的臨床應(yīng)用提供參考。 材料和方法: 1.槌果藤提取物的制備：使用95％乙醇提取。 2.正常人及硬皮病患者皮膚成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)：三株P(guān)SS患

4、者成纖維細(xì)胞分別取自三例病程短于2年的PSS患者新發(fā)皮損的活動(dòng)性邊緣，三株正常對照的成纖維細(xì)胞取自三位年齡、性別、取材部位與PSS患者匹配的J下常人皮膚。原代培養(yǎng)采用組織塊貼壁法。 3.槌果藤提取物對成纖維細(xì)胞增殖活性影響：用MTT法測槌果藤提取物對正常人及PSS患者成纖維細(xì)胞增殖活性影響。 4.槌果藤提取物對PSS成纖維細(xì)胞凋亡的影響：采用流式細(xì)胞技術(shù)。 5.槌果藤提取物對I型膠原mRNA水平表達(dá)的影響：半定量

5、RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增Ⅰ型膠原完整編碼區(qū)，以B-actin為內(nèi)對照。 6.槌果藤提取物對Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)的影響：細(xì)胞蛋白提取，用Western Blot法檢測Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)，以B-actin為內(nèi)對照。 7.MTT法檢測槌果藤提取物的抗氧化作用。 8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)以均值±SD表示，采用兩組樣本t檢驗(yàn)，用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用One-way ANOVA檢驗(yàn)組間差異，p<0.05為差異有顯著意義。

6、 結(jié)果: 1.槌果藤提取物可抑制系統(tǒng)性硬化癥患者成纖維細(xì)胞增殖，槌果藤提取物10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml對PSS患者成纖維細(xì)胞增長的抑制率分別為：15.3％、26.1％、33.0％。對正常人成纖維細(xì)胞的增殖無影響。顯微鏡下觀察加藥后的成纖維細(xì)胞與未加藥的細(xì)胞形態(tài)無明顯差異。 2.AnnexinV-FITC/PI染色經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，槌果藤提取物100μg/ml作用PSS成纖維細(xì)胞24h后與未加藥

7、相比，凋亡、死亡細(xì)胞無明顯增多。 3.槌果藤提取物可抑制系統(tǒng)性硬化癥患者成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原的mRNA表達(dá)，加藥12 h、24 h、48h對PSS患者成纖維細(xì)胞的抑制率分別為27.5％、37.1％、48.2％，對正常人成纖維細(xì)胞的Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)無影響。 4.槌果藤提取物作用72h對正常成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白合成無抑制作用，加藥濃度10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml對PSS患者成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白抑制率

8、分別為：17.5％、38.2％、46.3％，與未加藥組相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 5.用槌果藤提取物預(yù)處理72h可顯著降低過氧化氫對正常人及PSS患者成纖維細(xì)胞的損傷，與未加藥相比，加藥濃度10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml正常人細(xì)胞增殖活性分別增加20％、38.8％、44.7％，PSS患者增殖活性分別增加25.2％，66.4％，69.2％。對PSS患者成纖維細(xì)胞的保護(hù)作用明顯高于正常人。 結(jié)論: 1