基質(zhì)金屬蛋白酶8基因治療大鼠肝硬化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：Ⅰ、Ⅲ型膠原在肝細(xì)胞外過度沉積是肝纖維化、肝硬化形成的一個(gè)重要特征。然而，到目前為止仍沒有一種有效地治愈肝纖維化、肝硬化的方法。中性粒細(xì)胞膠原酶(MMP-8)能夠特異的降解Ⅰ型膠原，把MMP-8基因?qū)敫渭?xì)胞將有可能是降解膠原纖維有效的方法。本研究通過構(gòu)建一種能夠表達(dá)MMP-8的腺病毒，治療肝硬化的大鼠，探討其能否有效地降解膠原，減輕肝臟的纖維化程度。 方法：以質(zhì)粒pGW1GH-MMP8為模板，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(polym

2、erase chain reaction，PCR)和酶切重組技術(shù)克隆了全長的MMP-8基因(pro-MMP8)及其截短的MMP-8基因(tMMP-8)片段，構(gòu)建了復(fù)制缺損性腺病毒載體攜帶乙肝病毒(HBV)載體表達(dá)MMP-8基因的質(zhì)粒pDC-CH-tMMP8、pDC-C-MMP8，經(jīng)酶切鑒定正確后進(jìn)行質(zhì)粒的大量提取，并用同樣的方法制備對(duì)照質(zhì)粒pDC-CH-RFP2，構(gòu)建的質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGLOXAE1，3Cre共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞以

3、包裝、擴(kuò)增重組腺病毒。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，以3×10<'11>病毒顆粒尾靜脈注射治療硫代乙酰胺誘導(dǎo)的肝硬化大鼠模型，分別于2周、4周后處死動(dòng)物，0.3％戊巴比妥腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，收集血清保存于-70℃，做肝功能、肝纖四項(xiàng)等檢查，分離肝組織，部分用10％的福爾馬林固定，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查，其余-70℃保存?zhèn)溆谩?結(jié)果：成功構(gòu)建了表達(dá)MMP-8基因的腺病毒Ad-CH-tMMP8、Ad-C-MMP8，并運(yùn)用于治療肝硬化大鼠的研究。

4、在Ad-CH-tMMP8、Ad-C-MMP8尾靜脈注射肝硬化大鼠的體內(nèi)轉(zhuǎn)染研究中，轉(zhuǎn)染2周后相比于模型組和陰性對(duì)照組，肝纖維化程度減輕。HE染色及天狼猩紅染色結(jié)果顯示治療組肝細(xì)胞脂肪變性、肝細(xì)胞壞死及炎癥細(xì)胞浸潤均有減輕，可見不同程度的肝細(xì)胞再生，膠原纖維條索變細(xì)變窄，肝小葉結(jié)構(gòu)恢復(fù)，與模型組及陰性對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；羥脯氨酸含量測定結(jié)果顯示與模型組相比，治療組肝組織羥脯氨酸含量有所下降(28.97+2.36 VS

5、17.04±0.61、17.62±1.30)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異(P<0.05)，而Ad-CH-RFP2組較模型組又有所升高(30.89±3.67)；血清ALT測定結(jié)果顯示治療組、陰性對(duì)照組大鼠ALT升高，顯著高于正常組和模型組(P<0.05)，然而，與正常組、模型組、陰性對(duì)照組相比，治療組血清總膽紅素、血清白蛋白沒有顯著的變化，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。轉(zhuǎn)染4周，治療組大鼠肝纖維化程度繼續(xù)減輕。而在Ad-CH-RFP2對(duì)照組，纖維