重組腺病毒載體介導(dǎo)的反義基質(zhì)金屬蛋白酶-2基因治療增殖期血管瘤的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、腫瘤的血管新生(Angiogenesis)理論是由Folkman[1]于上個(gè)世紀(jì)七十年代首先提出，研究表明血管新生是實(shí)體瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，腫瘤從新生血管中獲取營(yíng)養(yǎng)和排泄廢物，腫瘤的微血管數(shù)量幾乎與所有的實(shí)體瘤的生長(zhǎng)和預(yù)后均密切相關(guān)。 細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)的降解是血管生成的關(guān)鍵一步[2]，基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)是參與基質(zhì)降解的最重要的蛋

2、白酶，它可以降解已知的所有基質(zhì)成分[3]。血管瘤的發(fā)生、增殖、消退與細(xì)胞外基質(zhì)有著極其密切的關(guān)系，其中基質(zhì)金屬蛋白酶與血管形成密切相關(guān)，是一種重要的促進(jìn)血管生成的蛋白酶，MMPs促使血管形成在增殖期血管瘤中的作用已引起重視，MMPs已成為治療增殖期血管瘤的重要靶標(biāo)。通過(guò)轉(zhuǎn)染反義MMP-2基因作基因治療，抑制增殖期血管瘤組織中MMP-2的分泌而降低MMP-2的活性，都將成為增殖性血管瘤治療的重要手段。 本研究采用反義MMP-2cD

3、NA基因在mRNA水平抑制靶基因表達(dá)的策略，采用重組腺病毒介導(dǎo)的反義MMP-2cDNA基因感染的方法，感染增殖期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞(vascularendothelialcell,VEC)和人增殖期血管瘤裸小鼠移植瘤，分別從體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)兩方面研究反義MMP-2cDNA基因感染對(duì)靶細(xì)胞或/和組織的生物學(xué)特性和血管新生的影響，探討反義MMP-2cDNA基因在治療增殖期血管瘤中的意義，為進(jìn)一步開(kāi)展臨床應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。該系列研究的目的、方法、結(jié)

4、果、結(jié)論如下：第一部分重組腺病毒介導(dǎo)的綠色熒光蛋白(Ad-GFP)和重組腺病毒介導(dǎo)的反義基質(zhì)金屬蛋白酶-2cDNA(Ad-aMMP-2cDNA)的擴(kuò)增、純化、鑒定和滴度測(cè)定目的擴(kuò)增、純化Ad-GFP和Ad-aMMP-2cDNA，鑒定目的基因，并測(cè)定滴度。方法在293腺病毒包裝細(xì)胞中復(fù)制和擴(kuò)增Ad-GFP和Ad-aMMP-2cDNA。反復(fù)凍融293細(xì)胞，提取腺病毒懸液，用氯化銫(CsCl2)梯度離心法純化腺病毒，用PCR方法鑒定目的基因，

5、在熒光顯微鏡下測(cè)定Ad-GFP的滴度，用空斑法測(cè)定Ad-aMMP-2cDNA的滴度。結(jié)果目的基因中含有500bp的人反向插入的MMP-2cDNA片段，獲取了實(shí)驗(yàn)所需的第四代重組腺病毒液(Ad-GFP和Ad-aMMP-2cDNA)，Ad-GFP的滴度為9.5×109efu/ml，Ad-aMMP-2cDNA的滴度為1.0×109pfu/ml。結(jié)論該實(shí)驗(yàn)制備了本研究所需的高滴度的Ad-GFP和Ad-aMMP-2cDNA。 第二部分反義

6、MMP-2基因影響人增殖期血管瘤的體外研究目的用Ad-aMMP-2cDNA感染原代培養(yǎng)的增殖期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞后，觀(guān)察其對(duì)體外培養(yǎng)的VEC生物學(xué)特性的影響，為進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。方法選用不同感染復(fù)數(shù)(multiplicityofinfection，MOI)的Ad-GFP感染原代培養(yǎng)的VEC(經(jīng)形態(tài)學(xué)觀(guān)察、免疫組化染色和電鏡觀(guān)察鑒定確認(rèn)后)，測(cè)定感染效率；用Ad-GFP和Ad-aMMP-2cDNA腺病毒液感染VEC，測(cè)定其生長(zhǎng)曲線(xiàn)(M

7、TT)；細(xì)胞的生長(zhǎng)周期和凋亡；分別用RT-PCR、明膠酶試驗(yàn)、免疫組化和WesternBlotting方法在分子水平和蛋白水平檢測(cè)MMP-2基因的表達(dá)。結(jié)果當(dāng)MOI=100時(shí)，VEC感染效率為84.3％，是理想的感染效率，并且對(duì)細(xì)胞的毒性作用較小，對(duì)VEC的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的影響，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果也證明這一點(diǎn)。反義MMP-2能明顯下調(diào)腫瘤細(xì)胞內(nèi)源性MMP-2表達(dá)。MMP-2免疫組化顯示感染反義MMP-2組表達(dá)MMP-2明顯減少。明膠酶試驗(yàn)

8、和WesternBlotting都說(shuō)明Ad-aMMP-2能抑制VEC分泌MMP-2，可以有效抑制VEC表達(dá)MMP-2。結(jié)論①用組織塊法原代培養(yǎng)增殖期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，經(jīng)含有G418的培養(yǎng)液兩次處理后，能獲得純度較高的VEC。②腺病毒介導(dǎo)的報(bào)告基因GFP在VEC中能夠有效感染并表達(dá)。③在體外實(shí)驗(yàn)中，反義MMP-2cDNA可以有效抑制VEC分泌MMP-2。 第三部分反義MMP-2基因影響人增殖期血管瘤的體內(nèi)研究目的研究反義MMP-2c

9、DNA基因感染對(duì)人增殖期血管瘤裸小鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響。方法將手術(shù)切除的人增殖期血管瘤的新鮮標(biāo)本切分為5mm×4mm×3mm小塊，于1小時(shí)內(nèi)移植于18只裸小鼠雙側(cè)腋部皮下，并觀(guān)察其生長(zhǎng)情況。待移植瘤塊成活后(45天)進(jìn)行分組治療，共三組：PBS組,Ad-GFP組，Ad-aMMP-2組，每組5只，共15只，隔日瘤內(nèi)注射一次，共注射四次。進(jìn)行大體觀(guān)察(副作用，腫瘤體積)；組織形態(tài)學(xué)的觀(guān)察(肉眼觀(guān)察、熒光檢測(cè)、HE觀(guān)察、電鏡觀(guān)察)；在蛋白水平檢

10、測(cè)反義MMP-2cDNA基因的表達(dá)；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)周期和凋亡；最后檢測(cè)微血管密度(micro-vasculardensity,MVD)的改變。結(jié)果成功地建立了荷瘤裸小鼠血管瘤移植模型；Ad-aMMP-2能抑制體內(nèi)血管瘤的生長(zhǎng)，沒(méi)有觀(guān)察到明顯的毒副作用；組織學(xué)切片能觀(guān)察GFP基因的表達(dá)；Ad-aMMP-2cDNA能夠抑制血管瘤組織表達(dá)MMP-2，并導(dǎo)致腫瘤MVD明顯減少。結(jié)論通過(guò)反義MMP-2基因阻斷人增殖期血管瘤的生長(zhǎng)是