砂仁揮發(fā)油治療胃腸黏膜炎性疾病的免疫藥理研究.pdf

1、研究背景： 砂仁是姜科植物陽(yáng)春砂Amomumvillosumlour.、海南砂AmomumlongiligulareT.L.Wu.或綠殼砂Amomumvillosumlour.var.xanthioidesT.L.WuetSenjen的干燥成熟果實(shí)。以廣東陽(yáng)春縣所產(chǎn)陽(yáng)春砂最著名，稱(chēng)為地道南藥砂仁。砂仁在中醫(yī)治療胃腸道疾病中應(yīng)用非常普遍，具有確切的醫(yī)療價(jià)值，可治療胃和十二指腸潰瘍、腸炎、小兒腹痛、慢性腹瀉、胃痛、腹瀉、腹脹、胃無(wú)力

2、等胃腸道疾病。砂仁含揮發(fā)油高達(dá)1.7-3％，因此砂仁研究重點(diǎn)多為其揮發(fā)油成份。 近年來(lái)對(duì)砂仁的化學(xué)成分和藥理活性研究日趨深入，但對(duì)治療胃腸道疾病的作用機(jī)理尚未明確。國(guó)內(nèi)對(duì)砂仁治療胃腸道疾病的文獻(xiàn)報(bào)道很多，大多集中于砂仁對(duì)胃腸道動(dòng)力影響的觀察，對(duì)藥理機(jī)制的研究也僅見(jiàn)砂仁對(duì)胃腸激素影響的檢測(cè)。本研究將以胃潰瘍(GU)和炎癥性腸病(IBD)兩種疾病為研究的切入點(diǎn)，從其細(xì)胞和分子機(jī)制出發(fā)，探討砂仁揮發(fā)油對(duì)胃腸黏膜炎癥的作用和免疫藥理機(jī)制

3、。 胃潰瘍是發(fā)生于賁門(mén)和幽門(mén)之間的潰瘍黏膜缺損超過(guò)黏膜肌層的一種消化性潰瘍，在人群中發(fā)病機(jī)率很高。胃黏膜損傷和潰瘍的形成伴隨著生長(zhǎng)因子在黏膜的表達(dá)，致炎細(xì)胞因子的誘生，以及血管活性物質(zhì)、一氧化氮(NO)和內(nèi)皮素的產(chǎn)生。胃潰瘍的愈合是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，涉及到壞死物質(zhì)的清除，肉芽組織的生長(zhǎng)，細(xì)胞移行、分化、增殖和細(xì)胞外基質(zhì)形成，新生血管生成，纖維組織和疤痕組織的形成以及上皮重構(gòu)等過(guò)程。有研究表明，一些與胃酸分泌、細(xì)胞移行、分化、增

4、殖和細(xì)胞外基質(zhì)形成及新生血管生成有關(guān)的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子參與了潰瘍的愈合，另外氧自由基和NO在潰瘍的損傷和愈合中也起著很重要的作用。 炎癥性腸病包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病，是一種以腸道炎癥和黏膜組織損傷為特征的腸道非特異性炎癥疾病，其產(chǎn)生的腸內(nèi)、腸外癥狀嚴(yán)重影響了病人的生活質(zhì)量，其發(fā)病率和癌變率在我國(guó)逐年上升。IBD的確切病因未明，但有充分的證據(jù)表明：易感基因、環(huán)境因素和黏膜免疫系統(tǒng)之間的復(fù)雜交互效應(yīng)是引起IBD的主要原因。目前

5、，免疫因素在IBD的發(fā)病學(xué)中最為肯定，很多證據(jù)表明循環(huán)和腸道局部細(xì)胞因子表達(dá)異常與IBD的發(fā)病及轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。與IBD關(guān)系密切的有致炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子，致炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子功能、數(shù)量異?；騼深?lèi)因子之間的失衡，可引起和放大黏膜的炎癥，進(jìn)一步加重腸黏膜的損傷。此外，腸上皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的凋亡也參與了IBD的發(fā)病過(guò)程，IBD患者的結(jié)腸黏膜凋亡細(xì)胞數(shù)異常增多導(dǎo)致潰瘍病變的形成，因此在IBD的發(fā)病機(jī)制中凋亡可能具有重要意義。

6、研究目的： 本研究采用水蒸氣蒸餾法從陽(yáng)春砂仁中提取出揮發(fā)油成分，對(duì)建立的胃潰瘍和結(jié)腸炎兩種動(dòng)物模型采用灌胃給藥法治療，觀察砂仁揮發(fā)油對(duì)損傷黏膜愈合的影響，以及循環(huán)和腸道局部的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的水平、胃腸道相關(guān)炎癥介質(zhì)的變化以及腸黏膜細(xì)胞凋亡的變化，探討砂仁對(duì)慢性胃腸道疾病的抗炎作用和免疫藥理機(jī)制，為砂仁在胃腸道疾病的治療奠定基礎(chǔ)，進(jìn)而為將砂仁開(kāi)發(fā)為有效的臨床制劑提供理論基礎(chǔ)。 研究?jī)?nèi)容和方法： (一)砂仁揮發(fā)油

7、的提取、質(zhì)量控制和急性毒性實(shí)驗(yàn)研究 采用水蒸氣蒸餾法從陽(yáng)春砂果實(shí)中提取揮發(fā)油成分，用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)分析砂仁揮發(fā)油的化學(xué)組成，并采用氣相色譜法(GC)檢測(cè)砂仁中乙酸龍腦酯的含量，以此作為揮發(fā)油的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。另外，我們對(duì)砂仁揮發(fā)油進(jìn)行了小鼠的急性毒性實(shí)驗(yàn)，以確定砂仁揮發(fā)油的半數(shù)致死量(LD50)，為藥理評(píng)價(jià)提供劑量設(shè)計(jì)的依據(jù)。 (二)砂仁揮發(fā)油對(duì)乙酸性胃潰瘍大鼠的治療作用及其免疫機(jī)理研究 采用

8、乙酸直接接觸漿膜的方法建立乙酸性胃潰瘍的動(dòng)物模型，將50只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、胃潰瘍模型組、法莫替丁組、砂仁揮發(fā)油高劑量組和砂仁揮發(fā)油低劑量組，每組10只。造模后第3d開(kāi)始給藥，正常組和模型組給予0.9％氯化鈉溶液90mg/(kg·d)，法莫替丁組給予法莫替丁4mg/(kg·d)，砂仁揮發(fā)油高、低劑量組分別給予砂仁揮發(fā)油乳劑300mg/(kg·d)和75mg/(kg·d)。給藥10d后處死，觀察砂仁揮發(fā)油對(duì)胃潰瘍大鼠的大體形態(tài)學(xué)、潰

9、瘍面積和體重的影響，并觀察其對(duì)胃潰瘍大鼠的組織病理學(xué)方面的影響，同時(shí)檢測(cè)大鼠外周血中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)濃度和一氧化氮(NO)濃度的變化。采用液相芯片(luminex)技術(shù)檢測(cè)了砂仁揮發(fā)油對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素-4(IL-4)在胃潰瘍大鼠外周血清中的變化，并使用免疫組化方法對(duì)表皮生長(zhǎng)因子(EGF)在大鼠胃黏膜組織中的表達(dá)情況進(jìn)行了觀察，來(lái)探討砂仁揮發(fā)油對(duì)胃潰瘍大鼠

10、胃黏膜的作用機(jī)理。 (三)砂仁揮發(fā)油對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎慢性炎癥期的治療作用及其免疫機(jī)理研究將58只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、結(jié)腸炎模型組、SASP組、砂仁揮發(fā)油高劑量組和砂仁揮發(fā)油低劑量組。采用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)/乙醇灌腸法制作大鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型，造模后第7d開(kāi)始給藥。正常組和模型組給予0.9％氯化鈉溶液0.09g/(kg·d)，陽(yáng)性對(duì)照組給予柳氮磺吡啶片(SASP)4mg/(kg·d)，砂仁揮發(fā)油劑量

11、組給予砂仁揮發(fā)油乳劑300mg/(kg·d)和75mg/(kg·d)。給藥14d后處死，通過(guò)觀察砂仁揮發(fā)油對(duì)各組大鼠的生存率、結(jié)腸宏觀表現(xiàn)、病理學(xué)變化、結(jié)腸濕重、大體損傷分?jǐn)?shù)、腹瀉和粘連的情況，評(píng)價(jià)其對(duì)結(jié)腸黏膜損傷愈合的影響；檢測(cè)結(jié)腸組織中髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性、SOD活性及MDA含量的變化，以判斷炎癥的嚴(yán)重程度和砂仁揮發(fā)油抗氧化的作用。并用luminex技術(shù)同時(shí)檢測(cè)結(jié)腸中的三種細(xì)胞因子：白介素-2(IL-2)、IL-4和TNF-α

12、水平的影響，采用TdT介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記技術(shù)(TUNEL)法檢測(cè)揮發(fā)油對(duì)結(jié)腸黏膜細(xì)胞凋亡的影響，探討砂仁揮發(fā)油對(duì)IBD作用的相關(guān)機(jī)制。 (四)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組檢測(cè)結(jié)果計(jì)量資料采用單因素方差分析(One-WayANOVA)，并進(jìn)一步做多重比較。生存率的比較采用x2檢驗(yàn)(Chi-SquareTest)。顯著性水平為：α=0.05。 結(jié)果結(jié)論： 1

13、.本實(shí)驗(yàn)采用水蒸氣蒸餾法從陽(yáng)春砂仁中提取揮發(fā)油，其得率為3.54％，在提取的砂仁揮發(fā)油中，共分離出96個(gè)化學(xué)成分，鑒定出其中63個(gè)成分，已鑒定的成分占揮發(fā)油總量的98.08％。主要為單萜類(lèi)和倍半萜類(lèi)化合物，還有非萜類(lèi)小分子的芳香族和脂肪族化合物。揮發(fā)油中含量大于1％的有乙酸龍腦酯、樟腦、檸檬烯、樟腦烴、龍腦、β-蒎烯、β-月桂烯和α-蒎烯8種化合物。急性毒性實(shí)驗(yàn)得出砂仁揮發(fā)油對(duì)小鼠灌胃的LD50為7200mg/Kg，按毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，屬實(shí)

14、際無(wú)毒類(lèi)物質(zhì)。 2.砂仁揮發(fā)油對(duì)胃潰瘍大鼠的潰瘍愈合具有促進(jìn)作用。可以改善胃潰瘍大鼠精神不振、倦怠嗜臥的癥狀，減輕胃潰瘍大鼠胃黏膜的組織病理學(xué)損傷。砂仁高、低劑量組均可以提高大鼠血清SOD值、NO含量和VEGF含量，減少大鼠血清MDA值；砂仁揮發(fā)油低劑量組的大鼠血清中IL-4水平顯著提高，砂仁高、低劑量組對(duì)血清中TNF-α水平?jīng)]有顯著影響。EGF的表達(dá)部位在胃黏膜腺體的頸部，以壁細(xì)胞、頸部細(xì)胞胞漿表達(dá)為主，砂仁揮發(fā)油的高、低劑量

15、組的大鼠EGF表達(dá)均為陽(yáng)性。 3.砂仁揮發(fā)油對(duì)結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜炎癥具有改善作用?？梢越档痛笫蠼Y(jié)腸濕重和大體損傷分?jǐn)?shù)，改善大鼠腹瀉的情況；同時(shí)減輕結(jié)腸炎大鼠結(jié)腸黏膜的病理組織學(xué)損傷。砂仁揮發(fā)油低劑量組可提高結(jié)腸SOD活性和MPO活性，同時(shí)使MDA含量顯著下降；砂仁揮發(fā)油高、低劑量組可下調(diào)造模后大鼠結(jié)腸黏膜中升高的致炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-2的水平，并且上調(diào)抗炎細(xì)胞因子IL-4的水平；砂仁揮發(fā)油可降低大鼠結(jié)腸黏膜過(guò)度增多的凋亡

16、細(xì)胞數(shù)目，凋亡主要發(fā)生在病變處及臨近的非病變處隱窩上皮細(xì)胞。 綜上所述，本課題在建立胃潰瘍和炎癥性腸病兩種動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，采用陽(yáng)春砂仁揮發(fā)油灌胃給藥，觀察其對(duì)上述兩種胃腸黏膜炎性疾病的作用，并從免疫學(xué)角度探討其作用機(jī)制。研究結(jié)果表明：砂仁揮發(fā)油對(duì)大鼠乙酸性胃潰瘍和實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎均具有緩解炎癥和促進(jìn)潰瘍愈合的作用，其機(jī)制可能和清除過(guò)量氧自由基，調(diào)控致炎和抗炎細(xì)胞因子的平衡，促進(jìn)胃黏膜生長(zhǎng)因子EGF的表達(dá)，以及下調(diào)結(jié)腸的異常細(xì)胞凋亡