新型生物復(fù)合材料-HA-ZrO2梯度復(fù)合材料對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)及成骨分化的影響.pdf

1、因創(chuàng)傷、感染、腫瘤等各種原因造成的骨缺損、骨不愈合一直是骨科治療領(lǐng)域的難題。常用的自體和異體骨移植各有自身難以克服的缺點(diǎn)，不能常規(guī)用于臨床。隨著組織工程的迅猛發(fā)展,為骨缺損修復(fù)提供了新的思路和治療途徑。
　　構(gòu)建理想的的組織工程化骨其前提就是要有生物學(xué)特性良好的種子細(xì)胞和適合的支架材料,支架材料的選擇是組織工程所需考慮的關(guān)鍵問(wèn)題之一。理想的骨組織工程的支架材料應(yīng)該滿(mǎn)足以下幾個(gè)條件:
　　(1)良好的生物相容性。
　　(

2、2)生物可降解吸收性以及吸收速率的可調(diào)性。
　　(3)一定的機(jī)械強(qiáng)度和韌性,在特定的部位能提供與局部環(huán)境相適應(yīng)的結(jié)構(gòu)上的支持作用。
　　(4)易于加工、塑行以便臨床用。
　　(5)具有三維內(nèi)聯(lián)多孔結(jié)構(gòu)，種子細(xì)胞的黏附生長(zhǎng)以及周?chē)M織的長(zhǎng)入決定了材料必須具備完備適宜的多孔性,包括一定的空隙率、孔徑大小以及完善的內(nèi)連接系統(tǒng)。
　　(6)材料表面有利于細(xì)胞黏附生長(zhǎng)、分化。目前在骨組織程中常用的支架材料主要有生物陶瓷、羥

3、基磷灰石(HAP)、人工可降解聚合物等，而多種成分的復(fù)合型支架材料的逐漸成為研究熱點(diǎn)。
　　本單位與上海大學(xué)高分子材料研究所合作采用干鋪-燒結(jié)的方法聯(lián)合研制了一種新型生物復(fù)合材料―HA/ZrO2梯度復(fù)合材料(Graded irconia-hydro xyap at- ite composite bioceramic)。使氧化鋯材料的高強(qiáng)度、高韌性和HA的生物活性有機(jī)地結(jié)合起來(lái)。根據(jù)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織ISO10993-1:1992醫(yī)療器

4、械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)和要求，本課題組已對(duì)HA/ZrO2梯度復(fù)合材料進(jìn)行了一系列體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究，前期研究發(fā)現(xiàn)HA/ZrO2梯度復(fù)合材料具有良好的骨誘導(dǎo)性和骨傳導(dǎo)性，無(wú)細(xì)胞毒性、無(wú)急性體內(nèi)毒性、不致溶血性，生物相容性和免疫相容性良好，成骨效能優(yōu)，能夠與骨界面形成良好的生物連接。
　　骨組織工程中的種子細(xì)胞要求其擴(kuò)增迅速,與支架材料有良好的相互作用,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs),因其可通過(guò)體外貼壁培養(yǎng)分離,擴(kuò)增迅速,是一類(lèi)具有分化潛能的細(xì)胞

5、,在特定條件下可以分化為多種組織細(xì)胞,如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌腱、脂肪細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及神經(jīng)星狀細(xì)胞等,且具有極強(qiáng)的自我復(fù)制能力,是一種理想組織工程種子細(xì)胞。以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和HA/ZrO2梯度復(fù)合材料復(fù)合構(gòu)建的組織工程化骨有望成為未來(lái)骨組織工程研究和應(yīng)用的主流。
　　組織工程學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容之一是支架材料對(duì)種子細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。目前HA/ZrO2梯度復(fù)合材料對(duì)MSCs生長(zhǎng)及分化的影響尚未得到充分闡明。本研究旨在詳細(xì)闡述作

6、為支架材料的HA/ZrO2梯度復(fù)合材料對(duì)于種子細(xì)胞MSCs生長(zhǎng)及成骨分化等生物學(xué)行為的影響，為未來(lái)的相關(guān)應(yīng)用提供數(shù)據(jù)參考。
　　實(shí)驗(yàn)分3個(gè)部分進(jìn)行觀察研究：
　　1.骨髓的獲取及MSCs的分離培養(yǎng)。用密度梯度離心法進(jìn)行MSCs的原代分離培養(yǎng)、消化傳代，繪制 MSCs的生長(zhǎng)曲線及倍增時(shí)間。同時(shí)進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的檢測(cè)分析包括MSCs的成骨誘導(dǎo)分化、Vonkossa染色、堿性磷酸酶染色、堿性磷酸酶（ALP）活性測(cè)定、總RNA提取及

7、RT-PCR。
　　2.HA/ZrO2復(fù)合材料顆粒對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖及成骨分化的影響。以不同濃度的材料懸液作用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，5天后進(jìn)行MTT檢測(cè)。15天后進(jìn)行堿性磷酸酶活性測(cè)定、Voncossa染色、總RNA提取及RT-PCR。
　　3.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在HA/ZrO2梯度復(fù)合材料、HA/ZrO2單純復(fù)合材料、純HA及ZrO2四種不同材料表面上貼壁增殖及成骨分化的差異。將細(xì)胞以相同濃度接種于不同材料薄片表面進(jìn)行貼

8、壁增殖實(shí)驗(yàn)。分別于1、4、7、11天后解離細(xì)胞并計(jì)數(shù)，繪制生長(zhǎng)曲線并計(jì)算倍增時(shí)間。 ALP檢測(cè)：分別于第10、20天裂解細(xì)胞后測(cè)堿性磷酸活性及總蛋白含量。均以普通孔板底面為對(duì)照。
　　通過(guò)以上研究，為新型生物復(fù)合材料-HA/ZrO2梯度復(fù)合材料的相關(guān)應(yīng)用提供參考數(shù)據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)獲得以下主要結(jié)果和結(jié)論：
　　1.本研究采用密度梯度離心法所分離得到的MSCs純度高，經(jīng)體外成骨誘導(dǎo)可向成骨細(xì)胞方向分化。
　　2.HA和

9、含有HA的復(fù)合材料顆粒均對(duì)細(xì)胞增殖有一定促進(jìn)作用。而單純ZrO2顆粒對(duì)細(xì)胞增殖沒(méi)有促進(jìn)作用。對(duì)于細(xì)胞分化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HA和含有HA的復(fù)合材料顆粒均對(duì)細(xì)胞ALP表達(dá)有一定促進(jìn)作用，說(shuō)明HA和含有HA的復(fù)合材料顆粒均可促進(jìn)MSCs的成骨分化。
　　3. MSCs接種于HA/ZrO2梯度復(fù)合材料、HA/ZrO2單層復(fù)合材料、純HA及ZrO2四種不同材料基質(zhì)表面，細(xì)胞均可貼壁、增殖與成骨分化。但其貼壁、增殖與分化的特征表現(xiàn)為復(fù)合材料基質(zhì)