恒定鏈CLIP兩個片段增強體液免疫效果的比較.pdf

1、主要組織相容性復(fù)合體(Major histocompatibility complex, MHC)，由緊密連鎖的多態(tài)性是高度相關(guān)的一組基因組家庭，它們是一個特定的染色體；其編碼的基因表達于不同的細胞表面，在細胞的免疫應(yīng)答過程中參與抗原的遞呈。MHCI基因和MHCⅡ基因的兩個亞科的主要基因MHC分子家族，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，γ鏈三聚體的MHC II類α，β-鏈及其聚合和聚合，形成特殊的九聚體(αβγ)3結(jié)構(gòu)[1]。二十世紀七十年代末，長期從事小鼠

2、分子功能性研究的Jones等學(xué)者[2]在研究時獲得了意外發(fā)現(xiàn)，α、β、γ三條鏈并非都是高度多態(tài)性，γ鏈是非多態(tài)性的，此現(xiàn)象在當(dāng)時所發(fā)現(xiàn)的各種小鼠中都是存在的，從而首次將γ鏈定義為恒定鏈（Invariant chain，Ii）。Ii是MHC II分子的伴侶蛋白，在維持Ii三聚體和MHC II六聚體之間結(jié)合結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性以及在機體免疫應(yīng)答的過程中的作用異常的明顯[3,4]。不止于此方面，Ii的CLIP在抗原呈遞過程中，會最早的結(jié)合到MHC II

3、類分子的凹槽結(jié)構(gòu)中，阻止某些機體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成的內(nèi)源性多肽與之結(jié)合[5]，經(jīng)過在細胞內(nèi)的相關(guān)物質(zhì)的轉(zhuǎn)移，Ii在特定的環(huán)境條件下被一點點的分解掉，最后分解CLIP，使其從MHC II類分子的結(jié)合凹槽中消失、某些特殊的抗原肽結(jié)合到這一結(jié)構(gòu)凹槽中，最終被呈遞到特定的免疫細胞表面[6]。近年來有相關(guān)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，用外源性的抗原肽替換Ii的CLIP區(qū)，能夠有效的增強免疫效果，這說明Ii是一直新型的免疫載體。隨著研究的深入，Ii自身的功能和結(jié)構(gòu)以及

4、在免疫應(yīng)答過程中的活動機理漸漸被人們所證實。
　　Ii的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，跨膜區(qū)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)區(qū)3個區(qū)域組成，其主要功能是輔助MHCⅡ類分子的外源性抗原肽。其81-216位的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔區(qū)含有CLIP（Class II-associated invariant chain peptide，81-104 aa）和三聚體區(qū)（TRIM, Trimerization）兩個主要片段。研究表明，在Ii的CLIP存在與MHCII類分子的結(jié)合位點（CBS，Cla

5、ss II binding site）片段。CBS片段又分為兩個功能片段，即與所有多態(tài)性MHCII結(jié)構(gòu)相關(guān)的混合結(jié)合位點（PBS，promiscuous binding site，81-87 aa）片段和溝槽結(jié)合位點（GBS，groove binding site，91-99 aa）片段。當(dāng)Ii的CLIP與MHCII類分子結(jié)合時，PBS存在于MHCII類分子的肽結(jié)合溝槽外部，同CLIP與MHCII類分子的解離有關(guān)，而GBS與MHC II

6、類分子的肽結(jié)合溝槽相互作用。
　　首先，通過對Ii的序列分析后，將其劃分為胞漿區(qū)、跨膜區(qū)、CLIP區(qū)、三聚體區(qū)，其中CLIP區(qū)又劃分為PBS、GBS兩個區(qū)，分段設(shè)計引物，同時用實驗室前期篩選的新城疫病毒NDV F蛋白的優(yōu)勢抗原表位F2，通過重疊延伸PCR技術(shù)，克隆構(gòu)建出含有F2抗原表位和不同Ii片段的嵌合體，將其構(gòu)建到pET-32a載體中，并將單獨的F2抗原表位連接到pGEX-4T-1載體中。通過PCR以及測序結(jié)果表明，所構(gòu)建的多

7、組重組質(zhì)粒中均含預(yù)期片段。
　　其次，對用于小量誘導(dǎo)表達構(gòu)建的8個重組質(zhì)粒，進行了誘導(dǎo)時間、IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度等多方面原核表達條件的優(yōu)化，以最佳條件進行大量表達。實驗中通過聚丙烯凝膠電泳檢測，8個重組質(zhì)粒均能在E.coli（DE3）中正確誘導(dǎo)表達，分子量分別為GST/F2：29.9 kDa、His/F2：23.9 kDa、His/Cyt/TM/F2：32.8 kDa、His/Cyt/TM/F2/GBS：34.7 kDa、His

8、/Cyt/TM/PBS/F2：34.4 kDa、His/Cyt/TM/F2/TRIM：45.1 kDa、His/Cyt/TM/F2/GBS/TRIM：46.9 kDa和His/Cyt/TM/PBS/F2/TRIM：46.7 kDa，與理論預(yù)期結(jié)果相符。我們將大量表達所得到的菌液進行洗滌離心、反復(fù)凍融以及超聲波破碎處理后，SDS-PAGE電泳檢測其表達形式，再通過Native-PAGE（非變性非還原性PAGE）和0.25 mol/L KC

9、l切膠純化法進行純化蛋白，得到濃度和純度均滿足實驗所需。
　　最后，用前期所得到的融合蛋白免疫6周齡的SPF級昆明系雌性小鼠。32只小鼠分8個組，期中7個組為實驗組，1個組空白對照組，每組4只。三次免疫間隔周期分別為10天和7天，第三次免疫后7天，經(jīng)眼球采血，分離收集血清抗體。再通過間接 ELISA法摸索最佳實驗條件，條件成熟后檢測不同的實驗組的抗體效價。結(jié)果表明，一是所構(gòu)建的含不同Ii功能片段/F2嵌合體的6個免疫組，均比單獨F

10、2的免疫組提高抗體水平1.5–4.9倍；二是在上述6個免疫組中，含CLIP的PBS或GBS的免疫組比不含CLIP的免疫組增強1.6-2.4倍；三是含PBS比含GBS的免疫增強作用高1.5倍。因此，我們得到結(jié)論，Ii胞漿區(qū)、跨膜區(qū)具有增強免疫的作用，而CLIP的PBS在Ii免疫載體中的作用優(yōu)于GBS。
　　綜上所述，本實驗成功克隆了基于小鼠Ii的CLIP區(qū)兩個片段和NDV F蛋白F2優(yōu)勢抗原表位的基因片段，連接到 pGEX-4T-1