小鼠恒定鏈短肽Ii-key增強免疫應(yīng)答的研究.pdf

1、主要組織相容性復(fù)合體(Majorhistocompatibilitycomplex，MHC)，是由一群緊密連鎖的基因群，定位于動物或人某對染色體的特定區(qū)域，呈高度多態(tài)性；其編碼的分子表達于不同細胞表面，參與抗原遞呈，制約細胞間相互識別及誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。MHC基因家族分為兩個主要的亞族：即Ⅰ類基因和Ⅱ類基因。MHCⅡ類分子的α、β鏈在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中與它的γ鏈聚合，形成九聚體。不同于α和β鏈的多態(tài)性，γ鏈為非多態(tài)性，被稱為恒定鏈(Invariant

2、chain，Ii)。Ii鏈是MHCⅡ分子重要的伴侶蛋白分子，它在MHCⅡ分子的正確折疊、組裝、結(jié)構(gòu)維持及表達蛋白和抗原呈遞中起重要的作用。在后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)Ii鏈跨膜區(qū)與CLIP區(qū)N端相連的四個氨基酸序列(LRMK)，與抗原表位連接后形成的嵌合體可以起到增強免疫應(yīng)答的效果，同時LRMK也被稱作Ii-key。本文研究了小鼠Ii鏈不同片段作為免疫載體在免疫應(yīng)答中的作用。
　　 首先，通過登錄GenBank數(shù)據(jù)庫獲得小鼠Ii鏈序列(登錄

3、號：NM01042605)，對序列分析后依據(jù)劃分的胞漿區(qū)、跨膜區(qū)、CLIP區(qū)、三聚化區(qū)分段設(shè)計多對引物，同時用實驗室保存的F306(新城疫病毒的NDVF蛋白的嵌合串聯(lián)表位)，克隆重組含有F306的不同Ii片段的基因嵌合體，將不同片段分別插入到原核表達載體pGEX-4T-1、pET-32a。經(jīng)PCR鑒定和測序結(jié)果表明各個重組質(zhì)粒均成功構(gòu)建。
　　 其次，誘導(dǎo)表達10個融合蛋白，在表達條件優(yōu)化處理后進行大量表達。大量表達的細菌經(jīng)反復(fù)

4、凍融和超聲裂解處理后，提取融合蛋白，用改良的KCL染色切膠法純化目的蛋白。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，10個重組質(zhì)粒均在大腸桿菌中正確表達，分子量分別為29.8KD、36.6KD、37.0KD、37.2KD、44.8KD、45.0KD、57.5KD、23.8KD、24.8KD、23.0KD，與理論預(yù)測結(jié)果一致。
　　 最后，用含有不同Ii片段載體F306抗原肽，免疫6～8周齡的雌性Balb/c小鼠，第三次免疫后經(jīng)眼球采血，分離血

5、清檢測抗體。間接ELISA法優(yōu)化條件后檢測不同實驗組抗體。檢測結(jié)果表明，攜帶Ii-key和CLIP區(qū)尾部DN的抗原肽抗體效價分別是單獨F306抗原肽的2倍和4倍，而增加胞漿區(qū)和跨膜區(qū)后抗體效價達到了單獨F306的7倍。用抗原肽F306取代CLIP區(qū)Ii抗體效價僅是單獨F306抗原肽的5倍。試驗中所用的F306是NDVF蛋白三個抗原表位(F72、F161和F343)的串聯(lián)嵌合體，分別單獨檢測這6組抗體，結(jié)果顯示F72的抗體效價明顯高于F1

6、61、F343，說明NDVF蛋白的優(yōu)勢抗原表位在66-92位氨基酸。
　　 綜上所述，本文成功克隆了小鼠Ii鏈基于Ii-key的不同功能區(qū)基因片段，并與表位基因F306組成了嵌合體；各片段分別插入到原核質(zhì)粒pGEX-4T-1、pET-32a中，經(jīng)表達后成功獲得了目的基因的融合蛋白；多種蛋白經(jīng)提純后免疫Balb/c小鼠，測定抗體效價，分析了小鼠Ii鏈多種片段作為載體在免疫應(yīng)答中的作用。為新型的恒定鏈活性片段載體疫苗的臨床應(yīng)用奠定了