器官培養(yǎng)法保存角膜的內(nèi)皮細(xì)胞活性研究及在基因轉(zhuǎn)染和移植排斥研究中的應(yīng)用.pdf

1、第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文器官培養(yǎng)法保存角膜的內(nèi)皮細(xì)胞活性研究及在基因轉(zhuǎn)染和移植排斥研究中的應(yīng)用姓名：魏捷申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：眼科學(xué)指導(dǎo)教師：蔣華20090501第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文檢測兔角膜內(nèi)皮層中Factin的表達(dá)以及TEM下CEC超微結(jié)構(gòu)的觀察。3去一t皮兔角膜片24只隨機(jī)分為4組，每組6只角膜，在添加2％FBS的ECM培養(yǎng)液中保存2～3周后與編碼增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)的腺病毒載體Ad5(滴度范圍5x106vp／uL

2、“5109vp／uL)37℃下共同孵育3h進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，隨后31℃下繼續(xù)器官培養(yǎng)觀察角膜2周。檢測前剝離大部分植片基質(zhì)，倒置熒光顯微鏡下觀察不同時(shí)間點(diǎn)EGFP在CEC中的表達(dá)強(qiáng)度，比較不同滴度組腺病毒載體的轉(zhuǎn)染效率、CEC計(jì)數(shù)，TEM觀察CEC超微結(jié)構(gòu)變化。4選用Wistar大鼠24只，SD大鼠54只，新西蘭大白兔12只。將54只SD大鼠隨機(jī)分為5組：①為正常角膜組成的對照組，②為新鮮大鼠角膜同種異體穿透性移植組(penetrating

3、keratoplasty，PKP)，③為去CEC同種異體大鼠角膜器官保存兔角膜后彈力層和內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)合體(DMcEC)移植組，④為器官培養(yǎng)法保存大鼠角膜同種異體PKP組，⑤為去CEC同基因大鼠角膜器官保存兔角膜DMCEC移植組。兔角膜保存時(shí)間2~3周不等。②～④組制備Wistar，SD大鼠PKP模型，⑤組制備SD，SD大鼠PKP模型。術(shù)后觀察各組植片的排斥情況和存活時(shí)間，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzymelinkedimmunosorbent

4、assay，ELISA)定量檢測房水和血清中自細(xì)胞介素2(IL2)、干擾素gamma(IFN7)、白細(xì)胞介素4(IL4)和腫瘤壞死因子0【(TNFQ)的表達(dá)，IHC法定性檢測術(shù)后植片內(nèi)CD25T細(xì)胞的表達(dá)，RTPCR半定量檢測植片內(nèi)TNF0【、IFN丫、IL4和CD25mRNA的表達(dá)，流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血中CD25和CD28亞群的表達(dá)。結(jié)果1結(jié)果顯示，ECM和ACF保存組角膜的ECD最高，細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)與正常角膜間的區(qū)別最小，MEM組的E

5、CD值則最低，降幅最大，細(xì)胞器等超微結(jié)構(gòu)破壞較嚴(yán)重。Factin和ZO1在各組兔和大鼠角膜內(nèi)皮層都有表達(dá)。WB顯示Factin蛋白在ECM和ACF組表達(dá)水平最高，DMEM組次之，MEM組最低，RTPCR法證實(shí)ZO1mRNA在各組的表達(dá)趨勢與兔F—actin的結(jié)果一致。2保存結(jié)束時(shí)含10％HESl30／04的實(shí)驗(yàn)組植片較薄，但ECD值略低于對照組。對照組經(jīng)葡聚糖T500脫水后，厚度和透明度與實(shí)驗(yàn)組差別變小，但ECD值明顯降低。IHC和WB