SPIO標(biāo)記自體骨髓間充質(zhì)細(xì)胞移植治療心肌梗死的MR成像研究.pdf

1、研究背景及目的:近年來，細(xì)胞治療、基因治療已成為心血管疾病治療的一類重要方法，并越來越受到重視。監(jiān)測活體內(nèi)移植入細(xì)胞的分布、增殖、遷移的方法雖然有多種，但傳統(tǒng)方法都需要在離體狀態(tài)下進(jìn)行組織學(xué)切片分析和鑒定，無法準(zhǔn)確地觀察植入細(xì)胞的生長分化情況，從而難以對干細(xì)胞移植術(shù)的療效作出客觀評價(jià)。這顯然難以滿足干細(xì)胞移植已進(jìn)入臨床應(yīng)用的現(xiàn)狀，因此，無創(chuàng)、可多次重復(fù)應(yīng)用的活體檢測方法已成為迫切需要解決的問題。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，已可從細(xì)胞分子水平闡

2、述疾病機(jī)制，成像技術(shù)也已向細(xì)胞分子水平發(fā)展。自1999 年分子影像學(xué)的提出，移植細(xì)胞的監(jiān)測進(jìn)入了嶄新的階段，人類開始能夠在細(xì)胞分子水平評價(jià)活體組織細(xì)胞的生物學(xué)過程。較之于同位素檢查，利用MR來監(jiān)測移植細(xì)胞的最大優(yōu)點(diǎn)是組織及空間分辨率高，可多序列、多角度成像，能很好顯示軟組織的解剖結(jié)構(gòu)。由于MR成像無法區(qū)分移植細(xì)胞和靶組織細(xì)胞，為使移植細(xì)胞能在MR上特異性顯示，目前廣泛使用超順磁性氧化鐵（superparamagnetic iron ox

3、id, SPIO）作為負(fù)性標(biāo)記物標(biāo)記移植細(xì)胞，進(jìn)行MR體外和活體內(nèi)的成像研究。因?yàn)殍F是順磁性物質(zhì)，可以使MR的T2WI和T2*WI圖像的靶區(qū)信號均明顯降低，產(chǎn)生負(fù)性對比劑的效應(yīng)，從而經(jīng)SPIO標(biāo)記的移植細(xì)胞團(tuán)也就可因含鐵顆粒而顯示為低信號，這樣就間接反映了移植細(xì)胞的分布和聚集情況。本實(shí)驗(yàn)采用MR進(jìn)行標(biāo)記細(xì)胞的體外失蹤及心肌梗死后移植細(xì)胞的活體內(nèi)示蹤，旨在明確SPIO體外標(biāo)記兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的適當(dāng)濃度和不同標(biāo)記濃度對細(xì)胞的生

4、物學(xué)活性影響，以及經(jīng)MR成像的特征和可成像的最低標(biāo)記細(xì)胞量等；嘗試在常規(guī)1.5T MR的成像條件下，對較小動物兔的心肌進(jìn)行解剖成像和移植細(xì)胞的進(jìn)一步示蹤；動態(tài)觀察移植細(xì)胞在心肌內(nèi)的活體成像特點(diǎn)及規(guī)律，為臨床干細(xì)胞移植治療心肌缺血性疾病的療效觀察與研究開創(chuàng)新方法。 實(shí)驗(yàn)方法:（1）MSCs 的培養(yǎng)及鑒定。取兔骨髓，對MSCs 進(jìn)行常規(guī)分離、純化和培養(yǎng)，觀察細(xì)胞在光鏡下的生長特征并記錄其生長曲線，對所獲得的細(xì)胞進(jìn)行表面抗原（CD3

5、4 和CD44）的檢測，確定所獲細(xì)胞絕大多數(shù)為MSCs。經(jīng)透射電鏡觀察MSCs 的超微結(jié)構(gòu)。（2）MSCs 具有向心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化能力的鑒定。觀察5-aza 誘導(dǎo)后橫紋肌α-actin 免疫細(xì)胞熒光染色結(jié)果，采用Western blot 法檢測MSCs 誘導(dǎo)后橫紋肌α-actin 的表達(dá)變化。對誘導(dǎo)后的細(xì)胞特點(diǎn)進(jìn)行透射電鏡觀察。（3）標(biāo)記細(xì)胞的體外成像。以不同濃度SPIO 標(biāo)記MSCs，觀察不同標(biāo)記濃度對細(xì)胞生物學(xué)活性的影響，包括細(xì)胞增

6、殖能力及形態(tài)的改變和生長曲線的變化；確定孵育時(shí)間和細(xì)胞標(biāo)記率；明確SPIO 標(biāo)記干細(xì)胞的適當(dāng)濃度閾值并經(jīng)MR 證實(shí)可成像的最低細(xì)胞量和最佳細(xì)胞量。（4）移植細(xì)胞的心肌內(nèi)注射及MR 活體示蹤。制備兔急性心肌梗死模型，將SPIO 標(biāo)記的MSCs 移植注入梗死心肌內(nèi)，經(jīng)MR 動態(tài)觀察移植細(xì)胞的定位、存活及遷徙。并經(jīng)超聲心動圖在移植前、后測定左心功能，評價(jià)細(xì)胞移植的療效，最后經(jīng)組織學(xué)檢查驗(yàn)證標(biāo)記細(xì)胞在心肌內(nèi)的存活及遷徙。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:（

7、1）骨髓單個核細(xì)胞懸液接種后24h開始有細(xì)胞貼壁，且搖晃瓶身貼壁細(xì)胞不易脫落。初期的貼壁細(xì)胞多為球形或短梭形，72h完全換液后可見貼壁細(xì)胞分裂增殖。（2）對貼壁生長的MSCs進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，提示傳代的細(xì)胞均一性較好，表面抗原CD34 表達(dá)陰性，CD44 表達(dá)陽性的細(xì)胞均在95％以上，說明得到的是比較純化的MSCs。（3）SPIO可有效標(biāo)記MSCs，二者共同孵育24h后的標(biāo)記率在95％以上。且細(xì)胞對鐵顆粒的吸收與細(xì)胞的數(shù)量、標(biāo)記濃度和

8、孵育時(shí)間呈正相關(guān)。20～50μg Fe/ml培養(yǎng)液是SPIO標(biāo)記干細(xì)胞的適當(dāng)濃度閾值，在該標(biāo)記濃度下細(xì)胞的生物學(xué)活性不受影響。超過50μg Fe/ml培養(yǎng)液濃度可使細(xì)胞的變形增殖能力受到不同程度的抑制。（4）SPIO標(biāo)記的MSCs在T2WI尤其是T2WI/FFE序列信號明顯降低；在35μg Fe/ml培養(yǎng)液標(biāo)記濃度下，MR可成像的最低細(xì)胞量為5×104；35μg Fe/ml培養(yǎng)液濃度時(shí)，標(biāo)記細(xì)胞1×105～5×104 MR成像既可使T2

9、WI、T2WI/FFE圖像信號均降低，而且沒有使靶灶擴(kuò)大的磁敏感偽影。（5）MR T1WI、T2WI、T2WI/FFE序列均可清晰成像示蹤梗死心肌內(nèi)注射的標(biāo)記MSCs，以FFE最為敏感，標(biāo)記細(xì)胞的定位、存活及遷徙均可在MR表現(xiàn)。MR可對標(biāo)記細(xì)胞示蹤至注射后3W，而T2W低信號可維持至注射后2W左右，T1W則僅能示蹤1W左右。各注射點(diǎn)的信號減低測量結(jié)果符合MR成像所見，并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)驗(yàn)證。（6）移植細(xì)胞注射前、后對兔梗死心肌的超聲心動圖檢查證

10、實(shí)，MSCs移植入心梗邊緣區(qū)后4w心臟功能有一定恢復(fù)，與心梗后即刻相比，左室收縮期室壁增厚率顯著提高（ P<0.05），左室壁運(yùn)動幅度增加，左室射血分?jǐn)?shù)提高，左室舒張末期容積縮小。（7）組織學(xué)檢查證實(shí)注射入梗死心肌與正常心肌交界處的MSCs存活，并在移植后4W的組織學(xué)檢測中發(fā)現(xiàn)了移植細(xì)胞的融合遷徙。 結(jié)論:聯(lián)合采用密度梯度離心和貼壁篩選的方法易于分離、純化獲得純度較高的MSCs。體外采用5-aza誘導(dǎo)下有部分MSCs向肌細(xì)胞分

11、化，證實(shí)MSCs為多潛能干細(xì)胞，具有表達(dá)肌細(xì)胞的特異性功能。SPIO可以簡便標(biāo)記MSCs并在適當(dāng)濃度下對MSCs的生物學(xué)活性沒有影響，MR T2WI和T2WI/FFE序列可敏感顯像磁性標(biāo)記的干細(xì)胞。臨床型1.5T MR可對兔梗死心肌內(nèi)的標(biāo)記細(xì)胞進(jìn)行無創(chuàng)性活體示蹤，并較長時(shí)間地動態(tài)觀測細(xì)胞的存活與遷徙。MSCs注射的部位是其向心肌細(xì)胞分化及心功能改善關(guān)鍵的影響因素，應(yīng)將MSCs投送到有存活心肌的梗死邊緣區(qū)，使其與存活心肌細(xì)胞直接接觸而向肌