pIRES2-EGFP-DAZ3質(zhì)粒構(gòu)建及金黃地鼠2-細(xì)胞胚中人DAZ基因的復(fù)制與表達(dá).pdf

1、1目錄中文摘要………………………………………………………………………………2英文摘要………………………………………………………………………………4主要縮略語(yǔ)中英文對(duì)照表……………………………………………………………7前言……………………………………………………………………………………9技術(shù)路線………………………………………………………………………………11材料與方法……………………………………………………………………………121材料……

2、……………………………………………………………………………122方法…………………………………………………………………………………132.1表達(dá)載體構(gòu)建………………………………………………………………….132.2目的cDNA表達(dá)…………………………………………………………………192.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理和樣本收集…………………………………………………….192.4探針的制備…………………………………………………………………….222.5實(shí)

3、驗(yàn)程序……………………………………………………………………….24試驗(yàn)結(jié)果……………………………………………………………………………..29討論…………………………………………………………………………………..36全文小結(jié)……………………………………………………………………………..41參考文獻(xiàn)……………………………………………………………………………..42綜述…………………………………………………………………………………..47附錄

4、：主要混合液及培養(yǎng)基………………………………………………………..56致謝…………………………………………………………………………………..613胎，制備間期核片，用FISH檢測(cè)DAZ3DNA是否能在間期核上復(fù)制；⑦收集2細(xì)胞胚胎，用RTPCR檢測(cè)DAZ3cDNA是否能在胚胎細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄?！窘Y(jié)果】【結(jié)果】①質(zhì)粒用質(zhì)粒用ApaⅠ和Ⅰ和NcoⅠ分別Ⅰ分別酶切酶切均可在相應(yīng)位置見(jiàn)特異條帶，說(shuō)明DAZ3片斷插入到pIRES2EGFP質(zhì)粒的位置正確

5、；②質(zhì)粒質(zhì)粒PCR用1％的瓊脂糖凝膠電泳得到PCR產(chǎn)物為538bp，說(shuō)明DAZ3片斷正確插入載體中；③細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染72小時(shí)后觀察轉(zhuǎn)染的NIH3T3細(xì)胞，可見(jiàn)綠色熒光蛋白的持續(xù)表達(dá)，說(shuō)明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功并能在體細(xì)胞中表達(dá)；④精子轉(zhuǎn)染后篩選計(jì)數(shù)精子轉(zhuǎn)染后篩選計(jì)數(shù)篩選后的轉(zhuǎn)染率有所提高；⑤精子精子PCR在精子樣本中可見(jiàn)DAZ3DNA陽(yáng)性條帶，洗滌液樣本斑點(diǎn)雜交結(jié)果陰性，排除了PCR陽(yáng)性結(jié)果來(lái)自洗液污染的可能性；⑥FISH在精子頭

6、部、單細(xì)胞胚雄原核和2細(xì)胞胚兩個(gè)間期核上觀察到DAZ3陽(yáng)性雜交信號(hào)；⑦RTPCR2細(xì)胞胚樣本可見(jiàn)DAZ3cDNA特異條帶。【結(jié)論】【結(jié)論】①重組質(zhì)粒構(gòu)建成功；②重組質(zhì)粒可以在體細(xì)胞中表達(dá)；③外源性DAZ3基因能通過(guò)精子膜進(jìn)入精子細(xì)胞并整合到精子基因組內(nèi)；④經(jīng)過(guò)篩選的精子轉(zhuǎn)染率可以提高；⑤攜帶DAZ3基因的精子可與其正常的卵母細(xì)胞完成受精過(guò)程；⑥導(dǎo)入的DAZ3基因在早期胚胎細(xì)胞中能夠隨細(xì)胞分裂自我復(fù)制并表達(dá)；⑦本研究證實(shí)精子可以作為外源基