pHIF-1α-EGFP-C-,2-質粒構建與鑒定.pdf

1、目的：缺氧誘導因子—1(hypoxia—inducible factor—1，HIF—1)是在缺氧狀態(tài)下特異性發(fā)揮活性的核轉錄因子，廣泛存在于缺氧條件下的哺乳動物和人體組織細胞內，可以調控許多靶基因的轉錄，具有多種生物學效應，在許多缺氧性疾病的病理過程中都發(fā)揮著重要的作用，因此是針對缺氧的最主要的應答因子之一。HIF—1由α亞基(HIF—1α)和β亞基(HIF—1β)組成。HIF—1α為HIF—1所特有，受氧調節(jié)，在功能調控方面起主要作

2、用。HIF—1β又稱為芳香烴受體核轉運蛋白(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator，ARNT)為哺乳動物芳香烴受體復合物的亞基，在細胞漿中穩(wěn)定表達。在正常氧飽和度下，HIF—1α亞基在翻譯后即被泛素—蛋白酶水解復合體迅速降解，半衰期僅為5min，因此細胞中基本檢測不到α亞基的表達，而在缺氧狀態(tài)下，α亞基的降解被抑制，α亞基和β亞基形成有活性的HIF—1，轉移到細胞核內調節(jié)多種基因的轉

3、錄。受到HIF—1調節(jié)的靶基因多達二百多種，這些基因表達后參與紅細胞生成，血管形成，核苷、氨基酸、糖的能量代謝，細胞存活、凋亡和活動以及藥物抵抗等生物學效應，以維持組織、細胞在缺氧條件下內環(huán)境穩(wěn)定，以適應缺氧。特別是在生理缺氧狀態(tài)下，如胚胎發(fā)育過程中干細胞的增殖與分化，以及多種病理情況如腫瘤的發(fā)展、轉移中，HIF—1及其下游基因均發(fā)揮著重要作用。正因為HIF—1α亞基在正常氧飽和度下翻譯后即被泛素—蛋白酶水解復合體迅速降解，半衰期僅為5

4、min，因此細胞中基本檢測不到α亞基的表達。使得關于HIF—1的研究受到極大的限制。本實驗采用基因工程技術，體外構建pHIF—1α/EGFP—C2真核細胞表達質粒載體，使得被轉染細胞能持續(xù)高水平表達HIF—1α。解決了HIF—1α脫離缺氧環(huán)境即迅速降解的難題。 方法：1.細胞培養(yǎng)：應用10％DMEM培養(yǎng)基(含10％FBS、100U/ml青鏈霉素)培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞(D3系)與人腎癌細胞(A498)于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱，每

5、3d換液1次，待細胞沿培養(yǎng)皿底部生長面積達80％—90％時，按常規(guī)方法傳代。兩種細胞分別給予氯化鈷(200uM)和3％O2缺氧培養(yǎng)兩種誘導方法處理4h、6h、16h。以37℃，5％CO2常規(guī)培養(yǎng)的D3小鼠胚胎干細胞組與A498人腎癌細胞作為對照。2.HIF—1α cDNA基因片段提?。禾崛】俶RNA，1％瓊脂糖凝膠電泳檢測mRNA完整性。以500ng總mRNA為模板，以Random9引物反轉錄為cDNA進行RT反應。以此cDNA為模板，

6、PCR擴增目的基因片段。1％瓊脂糖凝膠電泳。3.pHIF—1α-T原核細胞擴增載體構建：瓊脂糖凝膠回收PCR擴增HIF—1α基因片段，與線性T載體連接。轉化DH5α感受態(tài)細胞、藍白篩選、質粒提取均嚴格按照說明書操作。以SacⅠ酶和ApaⅠ酶進行雙酶切37℃，2h，1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。以M13—47、RV—M引物，DNA測序。4.pHIF—1α/EGFP真核細胞表達載體構建：(1) HIF—1α cDNA基因片段的制備。(2) pEG

7、FP—C2載體處理。(3) T4 DNA連接酶連接pEGFP—C2載體與HIF—1αcDNA基因片段。轉化DH5α感受態(tài)細胞。鋪含卡娜霉素(100ug/ml)的LB瓊脂平板篩選白色菌落，挑取數(shù)個菌落擴增后，提取質粒。以SacⅠ酶和ApaⅠ酶進行雙酶切37℃，2h，1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。以PCR引物，DNA測序。 結果：1.HIF—1α的RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，僅A498人腎癌細胞缺氧培養(yǎng)組見特異性擴增條帶，分

8、子量與理論預期相符，未見非特異擴增雜帶。并且隨著缺氧時間的延長，HIF—1α mRNA的轉錄水平逐漸提高。其它組均未見特異性擴增條帶。2.pHIF—1α-T擴增載體被雙酶切后產(chǎn)生2.6kb與1.7kb兩條片段。pHIF—1α-T擴增載體的測序結果表明，DNA序列與Genebank所公布的相關序列(NM001530)相同，無突變和移碼。3.pHIF—1α/EGFP—C2載體酶切后會產(chǎn)生4.7kb與1.7kb兩條片段。pHIF—1α/EGF