12854.木質(zhì)纖維素依賴型pediococcusacidilacticidq2中外源功能基因的表達及基因敲除

1、分類號：壘盈密級：UDC：華東理工大學(xué)學(xué)位論文木質(zhì)纖維素依賴型PediococcusacidilacticiDQ2中外源功能基因的表達以及基因敲除涂毅指導(dǎo)教師姓名：鮑杰教授華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)名稱：生物化工論文定稿日期：2013426論文答辯日期：2013531學(xué)位授予單位：華東理王太學(xué)學(xué)位授予日期：瑜橢6弱2確答辯委員會主席：盧艷花評閱人：張惠展周志華華東理工大學(xué)碩士學(xué)位論文第1頁木質(zhì)纖維素依賴型Pedioc

2、occusacidilacticiDQ2中外源功能基因的表達以及基因敲除摘要乳酸片球菌PediococcusacidilacticiDQ2是一株耐高溫和耐木質(zhì)纖維素降解抑制物的乳酸高產(chǎn)菌株。本文從兩個角度對PacidilacticiDQ2進行了改造，使其能夠更為適合于木質(zhì)纖維素生物煉制加工過程。首先，在PacidilacticiDQ2中建立了外源蛋白表達系統(tǒng)。對常用的乳酸菌表達載體pMG36e進行改造，將其啟動子P32更換為來源于Pac

3、idilacticiDQ2的L哥L酸脫氫酶基因的啟動子P7拋。并通過新載體pTY36e成功表達了兩種不同的外源基因：綠色熒光蛋白基因gfp(Aequoreavictoria)和B一葡萄糖苷酶基因培IA(Bacilluspolymyxa1794)，其中所表達的胞內(nèi)p葡萄糖苷酶活力為448U／(gdrycells)。此系統(tǒng)的成功構(gòu)建為后續(xù)對該菌的基因工程改造奠定了基礎(chǔ)。其次，對PacidilacticiDQ2染色體上的D乳酸脫氫酶基因ldh

4、D進行敲除以生產(chǎn)光學(xué)純的L一乳酸。將熱敏型敲除質(zhì)粒pSET4S上的壯觀霉素抗性基因更換成紅霉素抗性，并通過新質(zhì)粒pSET4E構(gòu)建敲除載體進行聊國的敲除。結(jié)果顯示，敲除菌株P(guān)acidilacticiAldhD112所產(chǎn)L一乳酸的光學(xué)純度達到9988％，并且在其胞內(nèi)幾乎檢測不到D乳酸脫氫酶酶活。由于D乳酸為此PacidilacticiDQ2菌株細胞壁肽聚糖的組成成分，對D一乳酸的消除使突變株對萬古霉素的抗性急劇的下降。AldhD112的構(gòu)建