采用轉(zhuǎn)染血液循環(huán)期原始生殖細(xì)胞方法和雞-兔異種動(dòng)物核移植方法制備轉(zhuǎn)基因雞.pdf

1、雞的原始生殖細(xì)胞(Primordial germ cells,PGCs)是雞各級(jí)生殖母細(xì)胞和成熟配子共同的祖先,最終發(fā)育分化成卵子或者精子.對(duì)雞PGCs進(jìn)行體外或者體內(nèi)轉(zhuǎn)染外源基因操作,再通過(guò)后代的篩選,就能獲得轉(zhuǎn)基因的后代.該論文首先對(duì)雞PGCs的遷移路徑進(jìn)行確定,然后根據(jù)PGCs遷移的位置進(jìn)行轉(zhuǎn)染外源基因,最后通過(guò)后代篩選獲得了轉(zhuǎn)基因的后代.同時(shí),采用異種動(dòng)物核移植和嵌合體制備的方法以期獲得轉(zhuǎn)基因雞.為此,該文主要進(jìn)行了以下研究:1

2、,雞PGCs遷移過(guò)程中的抗體檢測(cè):應(yīng)用兩種單克隆抗體MC-480和2C9對(duì)PGCs遷移的路徑和規(guī)律進(jìn)行確定.2,雞胚發(fā)育早期的性別鑒定和血液循環(huán)期PGCs含量的差異:在胚胎發(fā)育早期(13-17期)應(yīng)用M-PCR進(jìn)行胚胎性別的早期鑒定.3,胚胎背主動(dòng)脈注射對(duì)胚胎性腺中PGCs數(shù)量的影響:雞胚發(fā)育至14-16期,經(jīng)背主動(dòng)脈胚胎微注射DMEM,對(duì)雌性胚胎性腺切片PAS染色進(jìn)行PGCs計(jì)數(shù),結(jié)果表明正常發(fā)育組4枚胚胎PGCs的平均數(shù)為64±2.

3、97,機(jī)械損傷組5枚胚胎的平均數(shù)為51.6±4.23,兩者之間差異顯著(p<0.05).說(shuō)明背主動(dòng)脈注射造成胚胎性腺中PGCs的數(shù)量下降,但是其對(duì)胚胎的活性沒(méi)有影響.4,質(zhì)粒轉(zhuǎn)染血液循環(huán)期PGCs制備轉(zhuǎn)基因雞:雞胚胎發(fā)育至15期,脂質(zhì)體-質(zhì)粒DNA復(fù)合物進(jìn)行背主動(dòng)脈注射,轉(zhuǎn)染血管中循環(huán)期的PGCs來(lái)制備轉(zhuǎn)基因雞.根據(jù)注射質(zhì)粒類型的不同分成兩組,注射質(zhì)粒pEGFP-N1組和注射質(zhì)粒pEOVALG組,兩組PCR檢測(cè)結(jié)果表明5日齡、10日齡胚

4、胎和18日齡胚胎的基因組DNA中能夠擴(kuò)增出GFP基因上471bp的目的片段,注射質(zhì)粒pEOVALG組性成熟的1只母雞和2只公雞的血液中檢測(cè)到外源GFP基因的存在,后代PCR篩選未獲得轉(zhuǎn)基因的后代.注射質(zhì)粒pEGFP-N1組4只成年的母雞血液中檢測(cè)到外源GFP基因的存在,G0代母雞進(jìn)行后代PCR篩選的結(jié)果表明4只雞將外源基因傳遞給后代的效率從5﹪到53.6﹪.G1的血液樣品經(jīng)PCR擴(kuò)增后471bp的目的片段中,測(cè)序結(jié)果表明目的片段與pEG

5、FP-N1中GFP基因序列完全一致.利用質(zhì)粒pEGFP-N1中綠色熒光蛋白基因上的471bp的片段作為探針,與G1代的基因組DNA,進(jìn)行ECL法斑點(diǎn)雜交,27只G1斑點(diǎn)雜交的結(jié)果呈陽(yáng)性,轉(zhuǎn)基因種系傳遞的效率為19.6﹪(27/138).G1胚胎孵化36h,將胚胎整體取下,熒光顯微鏡下藍(lán)光激發(fā),觀察到胚胎整體呈綠色.G1胚胎孵育5d,熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明腎臟呈綠色.因此,轉(zhuǎn)染血液循環(huán)期PGCs可以高效獲得轉(zhuǎn)基因雞.5,雞—兔異種動(dòng)物核移

6、植獲得重構(gòu)囊胚:將雞的胚盤細(xì)胞注入到兔MⅡ期去核的卵母細(xì)胞中,重新構(gòu)建的雞—兔異種動(dòng)物克隆胚胎能夠發(fā)育到囊胚階段.當(dāng)X期雞的胚盤細(xì)胞注射到卵時(shí),83.51﹪的重構(gòu)胚體能夠融合,6.27﹪的融合胚胎能夠進(jìn)一步發(fā)育,形成與哺乳動(dòng)物相似的囊胚腔.PCR鑒定和核型分析的結(jié)果表明桑椹胚和囊胚的遺傳物質(zhì)來(lái)源于供體雞細(xì)胞.應(yīng)用線粒體特異性引物擴(kuò)增的結(jié)果表明重構(gòu)胚體中同時(shí)具有供體雞和受體兔的線粒體;單克隆抗體MC-480檢測(cè)和單克隆抗體2C9檢測(cè)呈陽(yáng)性