魯西黃牛體細(xì)胞克隆保種技術(shù)的研究.pdf

1、該試驗(yàn)以家畜活體保種規(guī)劃為基礎(chǔ),魯西黃牛為試驗(yàn)材料,利用組織塊培養(yǎng)法,首次建立了魯西黃牛耳皮膚上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞系,從屠宰場收集卵巢,回收卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體,培養(yǎng)成熟后的卵母細(xì)胞作為核受體,以第六代成纖維細(xì)胞作核供體進(jìn)行核移植,研究了體細(xì)胞克隆技術(shù)在家畜遺傳資源保護(hù)中的應(yīng)用,并獲得如下結(jié)果:1.通過組織塊培養(yǎng)法,獲得了傳代培養(yǎng)的魯西黃牛耳皮膚成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞.魯西黃牛皮膚細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)呈貼壁生長,原代與早期傳代細(xì)胞是上皮細(xì)胞與成

2、纖維細(xì)胞的混合物;2.傳代培養(yǎng)混合生長的細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶液37℃下消化處理2~3 min,脫壁懸浮的主要為成纖維細(xì)胞,采用反復(fù)消化法在傳代過程中將二者逐步分離純化,獲得了可正常傳代的魯西黃牛耳上皮細(xì)胞系和成纖維細(xì)胞系,表明采用反復(fù)消化法可以分離純化上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞;3.通過繪制生長曲線研究了魯西黃牛耳皮膚成纖維細(xì)胞的增殖規(guī)律,用高糖DMEM培養(yǎng)第四代魯西黃牛皮膚成纖維細(xì)胞,傳代后滯留期較短,約有1 d左右,活細(xì)胞逐漸貼壁生長

3、.此后進(jìn)入對數(shù)生長期,延續(xù)6 d左右.第八天細(xì)胞發(fā)生接觸抑制而開始死亡,細(xì)胞數(shù)量進(jìn)入平臺期,維持3 d左右,細(xì)胞逐漸脫落死亡,細(xì)胞數(shù)有所下降;4.染色體檢查表明,魯西黃牛耳皮膚成纖維細(xì)胞在適宜的培養(yǎng)體系,至少可以傳代至12代并保持染色體倍性正常;5.細(xì)胞冷凍試驗(yàn)中,以甘油與DMSO為冷凍保護(hù)劑,添加10%血清的DMEM為基礎(chǔ)液,同濃度DMSO作為冷凍液的防凍成分效果優(yōu)于同濃度甘油(p<0.05);DMSO與甘油濃度一定時(shí),血清濃度越高冷

4、凍效果越好(p<0.05);6.從冷凍魯西黃牛耳皮膚組織中成功培養(yǎng)出細(xì)胞,證明從冷凍保存的組織中進(jìn)行細(xì)胞的分離培養(yǎng)是可行的.冷凍組織培養(yǎng)出的細(xì)胞核型正常,與新鮮組織培養(yǎng)的細(xì)胞相同,可以用作細(xì)胞生物學(xué)及其它相關(guān)試驗(yàn)研究的材料;7.進(jìn)行體細(xì)胞克隆時(shí),采用血清饑餓法與生長抑制法處理供體細(xì)胞,結(jié)果分裂率有差異(p<0.05),但囊胚率無差異(p>0.05),說明兩者均可用于供體細(xì)胞的處理;8.用胚胎細(xì)胞差異染色法,對第七天的克隆重構(gòu)胚進(jìn)行細(xì)胞記