氧化魚油、丙二醛對草魚(Ctenopharyngodon idellus)肝胰臟、腸道膽固醇、膽汁酸合成代謝的影響.pdf

1、第一章草魚(Ctenopharyngodon idellus) HMGCR基因的全長克隆、生物信息學(xué)分析及組織表達(dá)分析
　　3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase，HMGCR）是內(nèi)源性膽固醇合成的關(guān)鍵限速酶，在維持膽固醇穩(wěn)態(tài)方面具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)利用cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）法獲得了草魚HMGCR基因的cDNA全序列。HMGCR全長3594bp

2、，5’端非編碼區(qū)（5’-UTR）長77bp，3’端非編碼區(qū)（3’-UTR）長988bp，開放閱讀框（ORF）為2529bp，編碼842個(gè)氨基酸組成的多肽鏈，分子量91.48kD，理論等電點(diǎn)6.27。草魚HMGCR蛋白包括兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：氨基端復(fù)雜的復(fù)雜的跨膜區(qū)域（Asp62-Leu219）和羧基端細(xì)胞溶質(zhì)催化區(qū)域（Asn419-Arg826）,這兩個(gè)序列通過一個(gè)可變的親水接頭序列（Val220-Ser418）連接起來，存在一個(gè)磷酸化位點(diǎn)（S

3、er827）和一個(gè)催化活性位點(diǎn)（His821），前39個(gè)氨基酸殘基（Met1-Ala39）為信號(hào)肽。由氨基酸同源性分析和進(jìn)化分析可知，草魚HMGCR與斑馬魚、麗脂鯉等鯉科魚類的進(jìn)化關(guān)系較近，與斑馬魚的同源性最高（89％）。通過組織表達(dá)分析表明，草魚HMGCR在被檢測的7個(gè)組織中都有表達(dá)，其中在肝胰臟中的表達(dá)量最高，其次為肌肉、腎臟和心臟。研究結(jié)果為進(jìn)一步開展對草魚HMGCR調(diào)控膽固醇代謝的分子機(jī)制研究提供了理論依據(jù)。
　　第二章草

4、魚(Ctenopharyngodon idellus) CYP7A1基因的全長克隆、生物信息學(xué)分析及組織表達(dá)分析
　　膽固醇7α羥化酶(cholesteral7αhydroxylase, CYP7A1)是膽汁酸經(jīng)典合成途徑的關(guān)鍵限速酶，在維持膽汁酸穩(wěn)態(tài)方面具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)利用 cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）法獲得了草魚CYP7A1基因的cDNA全序列。CYP7A1全長1771bp，5’端非編碼區(qū)（5’-UTR）長22bp，3

5、’端非編碼區(qū)（3’-UTR）長219bp，開放閱讀框（ORF）為1530bp，編碼509個(gè)氨基酸組成的多肽鏈。分子量57.74kD，理論等電點(diǎn)6.54。草魚CYP7A1蛋白包括兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：包含跨膜螺旋(Leu5-Leu22)的氨基端和包含保守核心序列的羧基端，其中氨基端疏水性強(qiáng)，保守性弱，而羧基端的半胱氨酸在這些物種中高度保守，前24個(gè)氨基酸（Met1-Ser24）為信號(hào)肽。由氨基酸同源性分析和進(jìn)化分析可知，草魚 CYP7A1與斑馬魚、

6、麗脂鯉等鯉科魚類的進(jìn)化關(guān)系較近，與斑馬魚的同源性最高（80%）。通過組織表達(dá)分析表明，草魚CYP7A1在肝胰臟中的表達(dá)量最高，其次為腎臟，在其他組織的表達(dá)量很少。研究結(jié)果為進(jìn)一步開展對草魚 CYP7A1調(diào)控膽固醇代謝的分子機(jī)制研究提供了理論依據(jù)。
　　第三章氧化魚油對草魚(Ctenopharyngodon idellus)肝胰臟、腸道膽固醇、膽汁酸合成代謝相關(guān)酶基因表達(dá)的影響
　　為了研究氧化魚油對草魚肝胰臟、腸道膽固醇、膽

7、汁酸合成代謝的影響。以豆油、魚油、氧化魚油作為飼料脂肪源，分別設(shè)計(jì)魚油組（6F）、豆油組（6S）、2%氧化魚油（2OF）、4%氧化魚油（4OF）及6%氧化魚油（6OF）5組等氮、等能半純化飼料，在池塘網(wǎng)箱養(yǎng)殖平均體重為（74.8士1.2）g草魚72天。采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（qRT-PCR）的方法，測定了草魚肝胰臟、腸道組織中四種膽固醇合成相關(guān)酶HMGCR、SREBP2、CETP、ABCA1和膽汁酸合成關(guān)鍵酶CYP7A1的基因表達(dá)活性

8、，結(jié)合血清、肝胰臟和腸道TC、TBA含量分析了膽固醇、膽汁酸的合成強(qiáng)度的變化。結(jié)果顯示：（1）添加氧化魚油后，草魚肝胰臟 HMGCR基因表達(dá)活性顯著上調(diào)（P<0.05），ABCA1和CYP7A1基因表達(dá)活性顯著下調(diào)（P<0.05），肝胰臟TC、TBA含量顯著增加（P<0.05）；（2）添加氧化魚油后，草魚腸道HMGCR基因表達(dá)活性顯著上調(diào)（P<0.05），CYP7A1基因表達(dá)活性顯著下調(diào)（P<0.05），腸道TC含量顯著增加（P<0.0

9、5），而TBA含量顯著減少（P<0.05）；（3）添加魚油或氧化魚油后，飼料∑PUFA含量與肝胰臟ABCA1基因表達(dá)活性呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P<0.05），飼料 MDA含量與腸道 ABCA1基因表達(dá)活性呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P<0.05）。結(jié)果表明，隨著飼料氧化魚油添加量的增加，在飼料∑ PUFA含量減少和魚油氧化產(chǎn)物MDA含量增加的交互影響下，肝胰臟和腸道細(xì)胞膽固醇合成能力、向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇的能力增強(qiáng)，向細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇的能力、以膽固醇為

10、原料合成膽汁酸的能力減弱，致使肝胰臟、腸道、血清膽固醇含量增加、而血清、腸道膽汁酸含量減少。肝胰臟膽汁酸含量增加，顯示肝胰臟有膽汁酸淤積的發(fā)展趨勢。預(yù)示著魚體生理代謝可能需要更多的膽固醇以滿足生理代謝的需要，而魚體膽汁酸可能出現(xiàn)供給不足。
　　第四章氧化魚油對草魚(Ctenopharyngodon idellus)膽固醇、膽汁酸合成代謝關(guān)鍵酶基因的時(shí)空表達(dá)
　　為了研究氧化魚油對草魚肝胰臟、腸道膽固醇、膽汁酸合成代謝在時(shí)間進(jìn)

11、程中的影響，探討在氧化魚油的影響下，腸道損傷與肝胰臟、腸道膽固醇、膽汁酸合成代謝的關(guān)系。以豆油、氧化魚油作為飼料脂肪源，分別設(shè)計(jì)豆油組（6S）、2%氧化魚油（2OF）、4%氧化魚油（4OF）及6%氧化魚油（6OF）4組等氮、等能半純化飼料，采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（qRT-PCR）的方法，測定了草魚肝胰臟、腸道組織中膽固醇合成關(guān)鍵酶HMGCR和膽汁酸合成限速酶CYP7A1基因時(shí)序表達(dá)活性，并結(jié)合血清、肝胰臟和腸道TC、TBA含量分析了膽

12、固醇、膽汁酸的合成強(qiáng)度的變化。結(jié)果顯示：在10-30天添加氧化魚油后，（1）血清、肝胰臟和腸道TC、TBA含量都顯著下調(diào)（P<0.05），此時(shí)，草魚肝胰臟和腸道HMGCR基因表達(dá)活性顯著上調(diào)（P<0.05），CYP7A1基因表達(dá)活性顯著下調(diào)（P<0.05）；（2）腸道Occludin基因表達(dá)活性和血清 DAO含量顯著下調(diào)（P<0.05）；（3）飼料 MDA含量與肝胰臟、腸道HMGCR基因表達(dá)活性均顯示正相關(guān)關(guān)系的變化趨勢，而與CYP7A

13、1基因表達(dá)活性均顯示負(fù)相關(guān)關(guān)系的變化趨勢；（4）飼料∑PUFA含量與肝胰臟、腸道HMGCR基因表達(dá)活性均顯示負(fù)相關(guān)關(guān)系的變化趨勢，而與 CYP7A1基因表達(dá)活性均顯示負(fù)相關(guān)關(guān)系的變化趨勢。在10-30天隨著氧化魚油添加量的增加，在草魚肝胰臟、腸道膽固醇含量減少的情況下，由于飼料∑PUFA含量減少和MDA含量增加的共同作用，引起了肝胰臟和腸道膽固醇合成能力的增強(qiáng)、膽汁酸合成能力的減弱，致使肝胰臟、腸道膽汁酸含量降低。氧化魚油可能通過損傷腸

14、道黏膜的方式先對腸道膽固醇、膽汁酸合成代謝造成影響，再對肝胰臟膽固醇、膽汁酸合成代謝造成影響。
　　第五章丙二醛對草魚(Ctenopharyngodon idellus)肝胰臟、腸道膽固醇、膽汁酸合成代謝相關(guān)酶基因表達(dá)的影響
　　為了研究MDA對草魚肝胰臟、腸道膽固醇、膽汁酸合成代謝的影響。以豆油為飼料脂肪源，根據(jù)等氮等能的原則，設(shè)置了一個(gè)對照組和三個(gè)MDA處理組的試驗(yàn)飼料，在池塘網(wǎng)箱養(yǎng)殖平均體重為（74.8士1.2）g草魚

15、72天。采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（qRT-PCR）的方法，測定了草魚肝胰臟、腸道組織中四種膽固醇合成相關(guān)酶HMGCR、SREBP2、CETP、ABCA1和膽汁酸合成關(guān)鍵酶CYP7A1的基因表達(dá)活性，結(jié)合血清、肝胰臟和腸道TC、TBA含量分析了膽固醇、膽汁酸的合成強(qiáng)度的變化。結(jié)果顯示：在飼料中添加MDA后，（1）草魚肝胰臟HMGCR、SREBP2、CETP基因表達(dá)活性顯著上調(diào)（P<0.05），ABCA1和CYP7A1基因表達(dá)活性顯著下調(diào)（

16、P<0.05），肝胰臟TC含量顯著增加（P<0.05），TBA含量顯著減少（P<0.05）；（2）草魚腸道HMGCR、SREBP2、CETP、ABCA1、CYP7A1基因表達(dá)活性顯著下調(diào)（P<0.05），腸道TC含量顯著增加（P<0.05），TBA含量顯著減少（P<0.05）；（3）飼料MDA含量與肝胰臟HMGCR、SREBP2、CETP基因表達(dá)活性均顯示正相關(guān)關(guān)系的變化趨勢，而ABCA1、CYP7A1基因表達(dá)活性均顯示負(fù)相關(guān)關(guān)系的變化

17、趨勢；（4）飼料MDA含量與腸道HMGCR、SREBP2、CETP、ABCA1、CYP7A1基因表達(dá)活性均顯示負(fù)相關(guān)關(guān)系的變化趨勢。結(jié)果表明，隨著飼料MDA含量的增加，肝胰臟膽固醇合成能力、向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇的能力增強(qiáng)，而腸道都在減弱，肝胰臟、腸道向細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇的能力、以膽固醇為原料合成膽汁酸的能力減弱，致使肝胰臟、腸道、血清膽固醇含量增加，而膽汁酸含量減少。預(yù)示魚體可能需要更多的膽固醇以滿足生理代謝的需要，而魚體需要的膽汁酸可能出

18、現(xiàn)供給不足。
　　第六章丙二醛對草魚(Ctenopharyngodon idellus)膽固醇、膽汁酸合成代謝關(guān)鍵酶基因的時(shí)空表達(dá)
　　為了研究MDA對草魚肝胰臟、腸道膽固醇、膽汁酸合成代謝在時(shí)間進(jìn)程中的影響，探討在MDA的影響下，腸道損傷與肝胰臟、腸道膽固醇、膽汁酸合成代謝的關(guān)系。以豆油作為飼料脂肪源，分別設(shè)計(jì)對照組（6S）、MDA-1、MDA-2、MDA-3共4組等氮、等能半純化飼料，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PC

19、R）的方法，測定了草魚肝胰臟、腸道組織中膽固醇合成關(guān)鍵酶 HMGCR和膽汁酸合成限速酶CYP7A1基因時(shí)序表達(dá)活性，并結(jié)合血清、肝胰臟和腸道TC、TBA含量分析了膽固醇、膽汁酸的合成強(qiáng)度的變化。結(jié)果顯示：在10-30天添加MDA后，（1）血清、肝胰臟和腸道 TC、TBA含量都顯著下調(diào)（P<0.05），此時(shí)，草魚肝胰臟和腸道HMGCR基因表達(dá)活性顯著上調(diào)（P<0.05），CYP7A1基因表達(dá)活性顯著下調(diào)（P<0.05）；（2）腸道Occl

20、udin基因表達(dá)活性和血清DAO含量顯著下調(diào)（P<0.05）；（3）飼料MDA含量與肝胰臟HMGCR基因表達(dá)活性均顯示正相關(guān)關(guān)系的變化趨勢，與肝胰臟、腸道CYP7A1基因表達(dá)活性均顯示負(fù)相關(guān)關(guān)系的變化趨勢。在10-30天隨著飼料添加MDA濃度的增加，在草魚肝胰臟、腸道膽固醇含量減少的情況下，肝胰臟和腸道膽固醇合成能力會(huì)增強(qiáng)、膽汁酸合成能力會(huì)減弱，導(dǎo)致了肝胰臟和腸道膽汁酸含量的減少。MDA可能通過損傷腸道的方式先對腸道膽固醇、膽汁酸合成代