病原菌在土壤組分上的界面作用與代謝活性.pdf

1、全球畜牧養(yǎng)殖業(yè)每年產(chǎn)生1010 t-1011 t的糞便排泄物，其中我國數(shù)量為3×109 t。這些廢棄物中含有大量腸道病原菌，以大腸桿菌、豬鏈球菌和沙門氏菌數(shù)量最多，若未經(jīng)有效處理就將其排放到土壤或作為有機(jī)肥施入到農(nóng)田，便會嚴(yán)重污染環(huán)境并威脅人類健康。近年來，世界各國報道了多起腸道病原菌污染問題，例如2005年我國四川的豬鏈球菌感染事件以及2011年歐洲的大腸桿菌中毒（毒黃瓜）事件，引起數(shù)千人染病或死亡。病原菌進(jìn)入土壤后，可吸附在土壤顆粒

2、上或隨水流進(jìn)行運(yùn)移，該過程深刻影響其感染活性和擴(kuò)散范圍。因此，有必要詳細(xì)研究病原菌與土壤的界面作用和代謝活性機(jī)制，以減緩類似事件的爆發(fā)，這對于預(yù)測病原菌在土壤環(huán)境中的分布規(guī)律和制定污染土壤修復(fù)方案具有重要理論和實(shí)際意義。本文以大腸桿菌（Escherichia coli）、豬鏈球菌(Streptococcus suis)以及多種土壤組分（粘土礦物、地帶性和非地帶性土壤）為材料，綜合運(yùn)用等溫吸附、土柱實(shí)驗(yàn)、掃描電子顯微鏡、微量熱、電位滴定、

3、傅里葉變換衰減全反射紅外光譜等技術(shù)，考察了菌株種類、溶液條件（pH和離子濃度）、土壤類型、有機(jī)質(zhì)含量和胞外聚合物對病原菌吸附的影響，獲得了細(xì)菌與不同土壤顆粒間的吸附能力、運(yùn)移距離、表面形貌、代謝活性和官能團(tuán)變化等信息。同時，借助zeta電位儀、PATH法(Particle adhesion tohydrocarbon)、比表面儀、X射線衍射和土壤物理化學(xué)性質(zhì)測定方法，系統(tǒng)測定了表面電荷、疏水性、比表面積、礦物組成、陽離子交換量、有機(jī)質(zhì)、

4、質(zhì)地、電導(dǎo)率等性質(zhì)，用以全面解釋互作機(jī)制。此外，運(yùn)用經(jīng)典的DLVO膠體穩(wěn)定理論(ClassicDerjaguin-Landau-Verwey-Overbeek theory)和統(tǒng)計學(xué)手段（一元線性回歸、偏相關(guān)和多元逐步回歸）分析細(xì)菌與土壤組分間的作用能信息和顯著性影響因素，揭示了吸附過程中的主導(dǎo)作用力及其貢獻(xiàn)程度。獲得的主要結(jié)果如下:
　　 (1)探明了病原茵在粘土礦物表面的吸附行為。二種病原菌在蒙脫石和高嶺石上的吸附等溫線符合

5、Freundlich方程(R2＞0.91)，豬鏈球菌在礦物上吸附的分配系數(shù)是大腸桿菌的2倍-8倍，蒙脫石對細(xì)菌的吸附量（0.63 mL g-1-5.07 mL g-1）大于高嶺石（0.58 mL g-1-1.23 mL g-1）。掃描電鏡圖片顯示，大腸桿菌呈桿狀，長度大于1μm，豬鏈球菌粒徑略小于大腸桿菌，呈卵圓形。提高溶液pH值(4.0-9.0)或降低離子濃度（20 mmol L-1-1 mmol L-1）能使細(xì)胞和礦物表面負(fù)電荷量逐

6、漸增多，靜電斥力變大，從而導(dǎo)致吸附量不斷減少。DLVO理論計算的作用能數(shù)據(jù)表明，斥力能障值在該溶液條件下不斷升高(1.4 kT-408.1 kT)，與吸附趨勢相吻合。各體系吸附量與對應(yīng)能障值呈顯著負(fù)相關(guān)(pH:Y=-0.031×X+13.4，R2=0.469，P＜0.01;離子濃度:Y=-0.004×X+2.7，R2=0.354，P＜0.05)，DLVO作用力（靜電斥力和范德華引力）顯著影響著吸附過程。高離子濃度下（20 mmol L-

7、1-100 mmol L-1），豬鏈球菌在2種礦物上的吸附量均出現(xiàn)顯著下降，偏離了DLVO理論的預(yù)測結(jié)果，由細(xì)菌胞外聚合物與礦物間的空間位阻作用（非DLVO作用力）引起。CaCl2對膠粒表面擴(kuò)散雙電層的壓縮作用更強(qiáng)，降低了互作體系間的能障值(0.8 kT-52.7 kT)，且能在細(xì)菌和礦物之間形成多價陽離子橋，對吸附量的促進(jìn)作用強(qiáng)于KCl。
　　 (2)揭示了病原菌在不同粒徑土壤顆粒中的吸附、運(yùn)移與代謝活性規(guī)律。土壤顆粒對病原茵

8、吸附能力的大致順序?yàn)?粘粒(＜2μm)＞粉粒(2μm-48μm)＞砂粒(48μm-250μm)，去有機(jī)質(zhì)顆粒(9.9×1010 cells g-1-59.4×1010 cells g-1)＞含有機(jī)質(zhì)顆粒(7.8×1010 cells g-1-43.9×1010 cells g-1)。土壤顆粒表面的zeta電位與比表面積大小與該趨勢一致，可從長程的擴(kuò)散雙電層作用力和表面位點(diǎn)角度解釋吸附行為，短程疏水作用力和陽離子交換量不能作為土壤-病原菌

9、相互作用的預(yù)測指標(biāo)。微量熱參數(shù)表明，相比對照體系（只含細(xì)菌和培養(yǎng)基），加入粉粒和砂粒后，豬鏈球菌生長的時間-功率曲線峰值PH相對于自由態(tài)細(xì)菌(289.6μW)升高了8.1％-27.1％，對應(yīng)出峰時間PT值(391.0 min-408.7 min)早于對照體系(424.7m in)，總體代謝活性增強(qiáng);粘粒體系PH值下降了11.4％-23.2％，出峰時間較晚(441.7 min-464.7min),豬鏈球菌代謝活性減弱。大腸桿菌在去有機(jī)質(zhì)粘

10、粒上的PH值(119.6μW)小于對照體系(147.2μW)，出峰時間更晚(313.5m in＞281.9m in)，活性受到抑制，其它5種土壤顆粒均促進(jìn)大腸桿菌的代謝活性。掃描電鏡直接證實(shí)了病原菌在砂粒和粉粒表面的吸附，細(xì)胞分布較為分散，有利于細(xì)胞對土壤顆粒表面吸附的營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行充分分解，促進(jìn)細(xì)菌的代謝活性。粘粒緊密包裹覆蓋在細(xì)胞上，外表面難以觀察到清晰的吸附態(tài)細(xì)菌，阻礙了細(xì)菌生長空間及其與外界營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的利用和交換，抑制其生

11、長和代謝過程。豬鏈球菌能運(yùn)移到20 cm深土層，比大腸桿菌運(yùn)移距離更遠(yuǎn)(10 cm)，物理阻塞對病原菌運(yùn)移的影響力高于吸附作用。
　　 (3)闡明了病原菌在土壤膠體顆粒上的作用力機(jī)制。豬鏈球菌在紅壤膠體表面吸附的分配系數(shù)（Kf）是大腸桿菌的4.5倍-6.1倍，細(xì)菌在去有機(jī)質(zhì)膠體表面吸附的Kf值為含有機(jī)質(zhì)膠體的2.4倍-3.2倍。比表面積越大或表面負(fù)電荷量越少，細(xì)菌吸附能力越強(qiáng)，大腸桿菌表面電荷密度較高(541.1μC cm-2)

12、，進(jìn)一步增強(qiáng)與土壤膠體間的靜電斥力。豬鏈球菌和大腸桿菌zeta電位與對應(yīng)吸附量可分別擬合指數(shù)和線性方程，吸附態(tài)細(xì)菌位于距土壤膠體表面90 nm-100 nm處的次級小能位置。隨著溶液體系pH降低(9.0-4.0)或KCl離子強(qiáng)度增大（1mmol L-1-10 mmol L-1），細(xì)菌與紅壤膠體互作能障降低(354.6 kT-0.3 kT)，次級小能引力增強(qiáng)(-0.020 kT--0.536kT)，分隔距離不斷縮短(111 nm-16 n

13、m)。此時細(xì)菌吸附量持續(xù)增大，與能障值呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05)，吸附機(jī)制符合DLVO理論，疏水作用力影響不顯著。高離子強(qiáng)度下（50 mmol L-1-100 mmol L-1），豬鏈球菌在去有機(jī)質(zhì)和含有機(jī)質(zhì)顆粒上的吸附量分別降低了3.4％和5.6％，細(xì)胞表面蛋白質(zhì)和土壤有機(jī)質(zhì)共同增強(qiáng)了空間位阻排斥力。
　　 (4)探討了土壤性質(zhì)與病原菌吸附能力間的相關(guān)性及貢獻(xiàn)程度。一元線性回歸結(jié)果表明，土壤溶液pH(P＜0.01)和電導(dǎo)率E

14、C(P=0.033)與豬鏈球菌分配系數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)，能分別解釋81.9％和38.4％的吸附過程。大腸桿菌分配系數(shù)僅與溶液電導(dǎo)率呈顯著正相關(guān)(P＜0.01)，R2值高達(dá)0.923。偏相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，在排除其它因素的間接影響后，pH(P=0.013)和電導(dǎo)率(P=0.034)分別是豬鏈球菌和大腸桿菌吸附的決定性因素。pH顯著促進(jìn)豬鏈球菌的吸附量(P＜0.05)，而電導(dǎo)率此時無顯著影響(P＞0.05)，對吸附能力有極微弱的促進(jìn)作用(偏相關(guān)系數(shù)為

15、0.298)，與一元線性回歸相矛盾。這是因?yàn)閜H和有機(jī)質(zhì)對吸附能力的抑制作用較大（偏相關(guān)系數(shù)分別為-0.952和-0.735），從而屏蔽了電導(dǎo)率對土壤的微弱影響，偏相關(guān)更能反映單獨(dú)的某種土壤性質(zhì)對細(xì)菌吸附的真實(shí)作用。土壤有機(jī)質(zhì)、粘粒含量、比表面積、陽離子交換量與分配系數(shù)無顯著相關(guān)(P＞0.05)，僅能單獨(dú)解釋30％以下的吸附行為。掃描電鏡手段顯示病原菌主要吸附于土壤團(tuán)聚體的外表面，無法吸附在團(tuán)聚體內(nèi)部的小尺寸顆粒表面。球面-平板DLVO

16、理論計算的能障值(Energy barrier,EB)與大腸桿菌分配系數(shù)Ks呈顯著負(fù)相關(guān):Ks=-0.057×EB+22.6(R2=0.577，P＜0.01，n=10)，但該模型無法解釋豬鏈球菌在土壤顆粒上的吸附行為。通過多元逐步回歸手段可得到病原菌分配系數(shù)與土壤性質(zhì)的相關(guān)性方程，豬鏈球菌:Ks=-45.93×pH-1.31×CEC+389.75(R2=0.929，P＜0.01);大腸桿菌:Ks=0.24× EC+2.005(R2=0.

17、932，P＜0.01)。該方程擬合值與實(shí)測值較為接近，相差數(shù)值小于14.3 mL g-1，可初步用來預(yù)測細(xì)菌在土壤表面的吸附能力。
　　 (5)明確了胞外聚合物對病原菌表面性質(zhì)及吸附能力的影響。采用陽離子交換樹脂(CER)去除細(xì)胞表面的胞外聚合物(Extracellular polymeric substances，EPS)，紅外光譜數(shù)據(jù)顯示，CER處理后的去EPS細(xì)胞在3500 cm-1-1000 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)的吸收峰均

18、有明顯降低、消失或偏移，表面相應(yīng)的蛋白質(zhì)、多糖和脂類物質(zhì)含量被去除。大腸桿菌細(xì)胞壁表面含有羥基、羧基、酰胺基、磷酸基、酯基、醛基、巰基等基團(tuán)，官能團(tuán)種類比豬鏈球菌更為豐富。去除EPS后，2種細(xì)菌表面電荷密度和總位點(diǎn)濃度分別降低了7％-17％和3％-7％。離子強(qiáng)度從1 mmol L-1上升到100 mmolL-1，細(xì)菌表面負(fù)電荷量逐漸減少。電荷量大小順序?yàn)?含EPS豬鏈球菌＜去EPS豬鏈球菌＜去EPS大腸桿菌＜含EPS大腸桿菌。4種細(xì)菌表

19、面疏水性范圍為3％-43％，去除EPS后，豬鏈球菌疏水性上升了約5％，大腸桿菌疏水性平均減少了11％。含EPS和去EPS細(xì)胞表面性質(zhì)受官能團(tuán)種類和EPS組成影響。含EPS豬鏈球菌在黃棕壤上吸附的分配系數(shù)Ks值最大(49.8 mL g-1)，其次是去EPS豬鏈球菌(16.1 mLg-1)、去EPS大腸桿菌(8.2 mL g-1)和含EPS大腸桿菌(8.0 mL g-1)。1mmol L-1-60mmol L-1離了強(qiáng)度下的吸附趨勢符合球面