大豆猝死綜合癥病原菌的土壤分離與分子檢測(cè)技術(shù)的研究.pdf

1、本研究為防止大豆猝死綜合癥病菌隨進(jìn)口的大豆傳入中國(guó)，保護(hù)我國(guó)的大豆生產(chǎn)，確立了大豆猝死綜合癥病菌的檢測(cè)技術(shù)，并應(yīng)用該技術(shù)對(duì)從幾個(gè)口岸采集的土樣進(jìn)行了檢測(cè)。 采用PCNB選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行土壤分離，SDS病原菌在PCNB上產(chǎn)生圓形白色菌落，菌落中心微隆，淡黃色，粉筆末狀。將菌落轉(zhuǎn)移至PDA培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，產(chǎn)生藍(lán)色不規(guī)則菌落，氣生菌絲少，這些菌落的特征可以作為鑒別SDS病原菌的一個(gè)重要指標(biāo)。在顯微鏡下觀察它們的孢子形態(tài)，F(xiàn).virg

2、uliforme、F.tucumaniae和它們的近似種的差別很小，都能產(chǎn)生鐮刀形的，有2-3個(gè)分隔的大分生孢子。 針對(duì)翻譯延長(zhǎng)因子(EF-1α)基因上的3個(gè)SNP(單核苷酸多態(tài)性)位點(diǎn)，參照引物設(shè)計(jì)原則和等位基因特異引物(allele-specificprimer，ASP)的要求設(shè)計(jì)篩選了一對(duì)引物Fsg-α-1/6，能特異地?cái)U(kuò)增F.virguliforme，產(chǎn)生327bp的電泳條帶。另外根據(jù)ITS區(qū)序列設(shè)計(jì)了一對(duì)通用引物Fu1

3、/2，能擴(kuò)增F.virguliforme和F.phaseoli，產(chǎn)生452bp的電泳條帶。并且在傳統(tǒng)的AS-PCR基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，引入Fu1/2作為陽(yáng)性質(zhì)控引物，將ASP的特異性與雙重PCR的嚴(yán)謹(jǐn)性相結(jié)合，使鑒定的結(jié)果更加穩(wěn)定可靠。另外在ITS2區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，能特異性地?cái)U(kuò)增F.virguliforme，產(chǎn)生650bp左右的條帶，進(jìn)一步完善了SDS病原菌北美種的檢測(cè)技術(shù)。 最后，應(yīng)用該技術(shù)對(duì)從各口岸采集的土樣進(jìn)行檢測(cè)，沒(méi)