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1、細(xì)菌依賴不同的信號(hào)調(diào)節(jié)系統(tǒng)以響應(yīng)不斷變化的環(huán)境,實(shí)時(shí)調(diào)整胞內(nèi)代謝途徑。病原菌的代謝途徑更為復(fù)雜,還需要高效的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)來(lái)介導(dǎo)細(xì)菌與宿主的相互作用,或逃避宿主的免疫系統(tǒng),建立感染。核苷類第二信分子和生物素都是細(xì)菌重要的信號(hào)分子,調(diào)控著包括中心代謝途徑、細(xì)胞組成、運(yùn)動(dòng)能力、毒力等重要的生理活動(dòng)。
(1) c-di-AMP對(duì)金黃色葡萄球菌小菌落突變體代謝和感染的調(diào)控機(jī)制研究
金黃色葡萄球菌(Staphylococcus
2、aureus)是人類重要的條件致病菌,可引發(fā)皮膚感染和呼吸道疾病。金黃色葡萄球菌小菌落突變體(S.aureus small colony variant,S.aureus SCV)通常是指甲萘醌、血紅素和胸腺嘧啶核苷等營(yíng)養(yǎng)缺陷型,其生長(zhǎng)緩慢,具有耐藥性,在固體培養(yǎng)基上形成微小菌落。胸腺嘧啶核苷依賴型小菌落突變體(S.aureus thymidine-dependent SCV,S.aureus TD-SCV)是由于胸腺嘧啶核苷酸合酶Th
3、yA失活突變引起的,必須通過(guò)攝取外源的胸腺嘧啶核苷而生長(zhǎng),通常在經(jīng)過(guò)磺胺甲惡唑和甲氧芐啶長(zhǎng)期治療的遺傳性囊性纖維化(cystic fibrosis)肺炎病人體內(nèi)出現(xiàn),引起嚴(yán)重感染,并造成肺損傷。
核苷類第二信使環(huán)二腺苷酸(c-di-AMP)是細(xì)菌特有的核苷類第二信使分子,由二腺苷酸環(huán)化酶合成,被特異性的磷酸二酯酶降解,真核生物缺乏合成或降解c-di-AMP的相關(guān)蛋白。c-di-AMP參與調(diào)控細(xì)菌中心代謝、細(xì)胞壁合成、滲透壓適應(yīng)
4、以及抗生素抗性等生理活動(dòng),并可與宿主細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)接頭蛋白STING結(jié)合,激活天然免疫反應(yīng)。
本研究通過(guò)分別敲除S.aureus Newman胸腺嘧啶核苷酸合酶基因thyA和膽色素原合酶編碼基因hemB得到了胸腺嘧啶核苷依賴型-SCVΔthyA和血紅素依賴型-SCVΔhemB。通過(guò)巨噬細(xì)胞、小鼠感染實(shí)驗(yàn)和Taqman免疫基因芯片分析,發(fā)現(xiàn)ΔthyA相對(duì)于野生型菌株和SCV對(duì)照菌株ΔhemB,在胸腺嘧啶核苷缺乏時(shí),能夠產(chǎn)生更高濃度的
5、c-di-AMP,激活依賴于STING蛋白的天然免疫反應(yīng)。而高濃度的c-di-AMP會(huì)導(dǎo)致ΔthyA基因組突變率升高,增強(qiáng)細(xì)菌的適應(yīng)性。本研究很好地解釋了TD-SCV能引起高炎癥反應(yīng),并造成更嚴(yán)重的肺損傷的原因。
PstA是一個(gè)PⅡ家族信號(hào)傳遞蛋白,同時(shí)也是c-di-AMP受體蛋白。本研究通過(guò)細(xì)菌雙雜交實(shí)驗(yàn)和體外酶活測(cè)定發(fā)現(xiàn),PstA在c-di-AMP的存在下能夠和胸腺嘧啶核苷酸激酶相互作用,并促進(jìn)其激酶活性,促進(jìn)胸腺嘧啶核苷
6、的利用,幫助ΔthyA在缺乏胸腺嘧啶核苷的環(huán)境下生存。本研究首次揭示了c-di-AMP通過(guò)調(diào)控胸腺嘧啶核苷利用而參與中心代謝的機(jī)制。
(2)蘇云金芽胞桿菌c-di-GMP核糖開(kāi)關(guān)Be2 RNA的調(diào)控機(jī)制研究
蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis)是一類桿狀、產(chǎn)芽胞的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌,也是昆蟲(chóng)致病菌。B.thuringiensis的生活周期主要分為營(yíng)養(yǎng)期和芽胞形成期,在芽胞形成期可以產(chǎn)生由殺蟲(chóng)晶體
7、蛋白組成的伴胞晶體,具有廣譜殺蟲(chóng)活性。目前,B.thuringiensis制劑目前是世界上使用最廣泛的微生物殺蟲(chóng)劑,研究B.thuringiensis生長(zhǎng)代謝、生活周期等有很大的應(yīng)用價(jià)值。
環(huán)二鳥(niǎo)苷單磷酸c-di-GMP是廣泛分布于細(xì)菌中的重要核苷類第二信使分子,通過(guò)結(jié)合不同的效應(yīng)蛋白或核糖開(kāi)關(guān)來(lái)調(diào)控細(xì)菌的毒力、細(xì)胞周期、生物被膜形成、運(yùn)動(dòng)性等多種生理活動(dòng)。細(xì)菌通過(guò)二鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶和磷酸二酯酶來(lái)控制胞內(nèi)c-di-GMP的濃度。核
8、糖開(kāi)關(guān)是位于mRNA非翻譯區(qū)的一段具有調(diào)控功能的sRNA,典型的核糖開(kāi)關(guān)由適體區(qū)域和下游的表達(dá)平臺(tái)區(qū)域緊密相連而成。
本研究發(fā)現(xiàn)在B.thuringiensis BMB171編碼膠原粘附蛋白(Cap) mRNA的5'-非翻譯區(qū)存在一個(gè)c-di-GMP核糖關(guān)Bc2 RNA。本研究通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄終止實(shí)驗(yàn),并在c-di-GMP低濃度和高濃度突變株中,通過(guò)β-半乳糖苷酶實(shí)驗(yàn)、熒光定量PCR實(shí)驗(yàn),揭示了Bc2 RNA表達(dá)平臺(tái)區(qū)的終止子結(jié)構(gòu)
9、會(huì)強(qiáng)烈地抑制下游基因cap的轉(zhuǎn)錄,當(dāng)結(jié)合c-di-GMP后,會(huì)引起B(yǎng)c2 RNA變構(gòu),并形成抗終止子結(jié)構(gòu),解除對(duì)cap的轉(zhuǎn)錄抑制。敲除Bc2 RNA會(huì)導(dǎo)致cap超表達(dá),從而抑制細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)、胞外多糖的分泌和生物被膜的形成,同時(shí)促進(jìn)細(xì)菌的沉降并影響細(xì)菌對(duì)棉鈴蟲(chóng)的毒力。本研究首次提出了“抑制-去抑制”模型,并且Bc2 RNA是蠟樣芽胞桿菌群中第一個(gè)被實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證功能的c-di-GMP核糖開(kāi)關(guān)。
(3)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子BioQ介導(dǎo)的生物素合成
10、調(diào)控系統(tǒng)研究
結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)感染引起的慢性傳染病,可以感染人體的各種器官或組織,但主要侵染肺部。大多數(shù)抗結(jié)核藥物只對(duì)生長(zhǎng)期的結(jié)核分枝桿菌有效,而不能清除潛伏期的結(jié)核分枝桿菌,多耐藥結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)使得結(jié)核病的防控形勢(shì)變得更加嚴(yán)峻,現(xiàn)有的抗結(jié)核藥物已經(jīng)不能滿足醫(yī)療的需要,迫切需要從結(jié)核分枝桿菌鑒定新的靶標(biāo),開(kāi)發(fā)出新型藥物。
生物素是所有生物都必須的維生素
11、。它作為羧化酶的輔因子,對(duì)分枝桿菌的中心代謝和脂肪酸合成途徑非常重要,活動(dòng)期和潛伏期的結(jié)核分枝桿菌都必須依賴自身合成生物素而生存,破壞生物素合成途徑會(huì)抑制結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)并導(dǎo)致其喪失致病性。哺乳動(dòng)物不具有生物素合成相關(guān)的基因,所以生物素合成途徑已經(jīng)成為新型抗結(jié)核藥物的靶標(biāo)。
本研究以生長(zhǎng)迅速、不致病的恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)為模式菌株,系統(tǒng)地探究了生物素代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制,為分枝桿菌生物素代謝研究奠定了
12、基礎(chǔ)。
經(jīng)典的生物調(diào)節(jié)系統(tǒng)依賴雙功能酶BirA,一方面作為生物素-蛋白連接酶調(diào)控生物素的利用,一方面作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子控制生物的合成與轉(zhuǎn)運(yùn)。分枝桿菌的BirA缺乏轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的功能,我們?cè)趷u垢分枝桿菌中鑒定到了一個(gè)TetR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子BioQ,它補(bǔ)償了BirA轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的功能,本研究揭示了以BirA和BioQ協(xié)同介導(dǎo)的生物素代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)。
BioQ是TetR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,本研究通過(guò)凝膠阻滯、DNaseⅠ足
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