殼寡糖誘導的灰霉孢子胞內活性氧動態(tài)及蛋白質差異表達研究.pdf

1、灰霉（Botrytis cinerea）侵染引起腐爛是造成果實采后損失的重要原因之一，目前最常用的病害防治方法是使用化學殺菌劑，但近年來化學農藥濫用所引起的殘留和環(huán)境污染已引起公眾的廣泛關注，因此，可替代的生物農藥的研發(fā)成為果蔬產后領域的研究熱點。殼聚糖是一種具有活性氨基和羥基的堿性多糖，有多種生物學功能，已有研究表明殼聚糖及其降解產物殼寡糖可以有效地抑制灰霉病的發(fā)生和擴展，且具有綠色環(huán)保、易降解、生物相容性等傳統(tǒng)農藥不具有的優(yōu)勢特點，

2、具有廣闊的應用前景。目前，對殼聚糖及殼寡糖對灰霉的抑制規(guī)律已有大量的研究報道，但關于其抑菌機理方面的認識不足，影響其未來在農業(yè)上的推廣應用。本論文采用熒光標記和蛋白質組學的方法，從細胞學和生物化學角度開展了殼寡糖抑菌機制的研究，結果如下。
　　通過熒光分子標記技術，觀察不同濃度殼寡糖單獨或外源添加過氧化氫、還原劑過氧化氫酶處理對灰霉孢子內部活性氧在0，15，30，45，60，90，120，150和180min各時間點的動態(tài)變化情況

3、。在不同濃度的殼寡糖處理中，選取0.5％和0.05%高低兩種濃度，發(fā)現殼寡糖處理組與對照組在0min均存在有微弱的ROS信號，對照組在15min之后ROS信號基本消失，殼寡糖處理組ROS信號隨時間延長呈現迅速下降后逐步增加的趨勢，低濃度殼寡糖處理組的ROS信號略強于高濃度殼寡糖處理組，兩者誘導的ROS在120min左右強度基本相同。經過50mmol/L外源過氧化氫誘導灰霉孢子1h后，發(fā)現過氧化氫誘導組與對照組相比，ROS信號明顯降低，且

4、這種差距隨著作用時間的延長逐漸縮短，在120min左右實驗組與對照組的ROS水平基本相同。用3mg/ml過氧化氫酶作為還原劑處理灰霉孢子，發(fā)現還原劑處理組的ROS水平明顯低于殼寡糖對照組，兩者的差距在60-90min達到最大，90min之后差距逐漸縮短，在180min左右ROS水平基本持平。激光共聚焦顯微鏡觀察殼寡糖處理組與對照組的ROS在灰霉孢子內部的分布情況，發(fā)現對照組中孢子內部的ROS分布均勻且信號微弱，殼寡糖處理組中孢子內部的R

5、OS主要分布在四周區(qū)域，中間大面積區(qū)域基本沒有ROS信號的存在?；钚匝鯚晒鈽擞浀慕Y果表明，殼寡糖處理顯著誘導了灰霉孢子內ROS水平的積累，且ROS濃度與作用時間有一定的正相關性，低濃度的殼寡糖誘導效果略好于高濃度殼寡糖；經低濃度過氧化氫誘導的灰霉孢子，在一定時間范圍內，可以提高灰霉孢子對ROS的耐受能力；外源添加過氧化氫酶，可以顯著降低殼寡糖對灰霉孢子內部ROS的誘導；殼寡糖處理的灰霉孢子，不僅其內部ROS水平高于對照組，而且在胞內分布

6、不均，細胞中央位置的ROS極少分布，同時，殼寡糖誘導使灰霉孢子的內部結構發(fā)生改變。
　　選擇濃度為0.05%的殼寡糖處理灰霉孢子8h，用Tris飽和酚抽提的方法提取灰霉孢子內部全蛋白，經過雙向電泳、和圖譜比對，發(fā)現差異表達蛋白質點61個，對其中28個點進行了質譜鑒定，質譜分析和數據庫搜索查詢，成功鑒定出23個蛋白點，共18種蛋白質，其中表達量上調的有4種，下調的有14種，除功能不明確的蛋白之外，其功能分別與物質代謝，蛋白合成，蛋白