Hypodermins A，B，C基因cDNA在大腸桿菌中的表達及牛皮蠅蛆病ELISA診斷方法的建立.pdf

1、牛皮蠅蛆病是一種危害嚴重的人畜共患病，每年都給養(yǎng)牛業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。國內(nèi)外研究表明紋皮蠅Hypoderomin A(HA)，Hypodermin B(HB)和Hypodermin C(HC)是該病血清學診斷和免疫疫苗的候選抗原．由于獲得牛皮蠅蛆Ⅰ期幼蟲比較困難，利用蟲體粗蛋白作為抗原在血清學診斷和免疫防治中的研究越來越少。為了獲得較多的、純化的重組蛋白，本課題進行了牛皮蠅Ⅰ期幼蟲三種免疫相關(guān)蛋白在大腸桿菌中的表達和純化，并建立了牛皮

2、蠅蛆病的ELISA診斷方法，為以后進一步的研究奠定了基礎(chǔ)。 本研究從紋皮蠅Ⅰ期幼蟲中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)Genbank上的Hypodermins A，B，C基因序列設計上下游引物，PCR擴增HA，HB和HC基因，將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T simple vector載體上并進行序列測定。序列測定正確的目的片段(HA、HB、HC)亞克隆到原核表達載體中構(gòu)建重組表達載體(pETHA、pETHB、pETHC)并轉(zhuǎn)

3、化到表達宿主菌BL21(DE3)中。以優(yōu)化的表達條件誘導表達，SDS-PAGE電泳檢測，Western-blotting檢測重組蛋白的免疫活性。三種重組表達菌誘導表達后，提取重組蛋白包涵體，經(jīng)8M尿素變性，透析復性或SEC柱上復性后，再以葡聚’糖凝膠Sephadex G-75進行純化。分別以蟲體粗蛋白和純化的重組蛋白為檢測抗原，建立牛皮蠅蛆病的血清學診斷方法。經(jīng)研究得到如下結(jié)果： 1．從紋皮蠅Ⅰ期幼蟲中提取了總RNA，用RT-P

4、CR技術(shù)擴增獲得了HA、HB和HC基因cDNA，大小分別為697bp、697bp和715bp。 2．分別將HA、HB、HC基因cDNA與克隆載體pMD19-T連接，構(gòu)建了重組克隆載體pTHA、pTHB和pTHC。 3．序列分析表明，HA基因序列同GenBank上公布的兩個序列(登錄號：L24914，X74303)核苷酸同源性分別為100％和99.71％：氨基酸同源性分別為100％和99.56％。HB基因序列同GenBan

5、k上公布的三個序列(登錄號：L24915，X74304，X74305)核苷酸同源性分別為98.97％、98.97％和95.74％：氨基酸同源性分別為98.23％、98.23％和93.36％。HC基因序列同GenBank上公布的兩個序列(登錄號：AB054066，X74306)核苷酸同源性分別為100％和99.42％：氨基酸同源性分別為100％和99.57％，說明本實驗所采集的蟲株與國外報道的蟲株有很高的同源性。 4．成功構(gòu)建了原

6、核表達載體pETHA、pETHB和pETHC，并實現(xiàn)了HA、HB和HC在大腸桿菌中的表達，重組蛋白均以包涵體的形式存在，表達量分別達到全菌蛋白的35％、30％和30％。 5．Western blotting結(jié)果表明，重組蛋白rHA、rHB和rHC能與牛皮蠅蛆感染牛血清IgG特異性結(jié)合，表明表達產(chǎn)物具有免疫活性。 6．重組蛋白rHA、rHB和rHC分別以0.2mg/ml、0.5mg/ml和1.0mg/ml的初始濃度透析復性

7、，并在Sephadex G-75層析柱上得到了純化。 7．對重組蛋白rHA、rHB、rHC在SEC柱上的復性進行了探索性研究，三種重組蛋白均能在SEC柱上復性。 8．分別以蟲體粗蛋白和重組蛋白rHC作為檢測抗原建立了牛皮蠅蛆病的ELISA檢測方法，特異性分別為100％和95.8％，敏感性分別為98.36％和100％。 9．以蟲體粗蛋白和rHC建立的ELISA診斷方法檢測采集于內(nèi)蒙古地區(qū)的233份牛血清，感染率分別