葡萄球菌誘導斑馬魚皮膚免疫相關基因差異表的的研究.pdf

1、魚類皮膚黏膜是黏膜免疫系統(tǒng)的重要組成部分,越來越多的研究表明魚類皮膚黏膜可獨立完成抗原攝取、遞呈及分泌抗體等功能,在魚類抵抗外來病原侵襲方面發(fā)揮著極其重要的作用,但其在免疫應答過程中表達的免疫相關基因目前尚不完全清楚。本研究的總體思路是利用基因芯片技術檢測經(jīng)致死劑量產(chǎn)色葡萄球菌處理和未處理的斑馬魚(Danio rerio)皮膚,檢測和分析感染后斑馬魚免疫應答早期皮膚組織差異表達基因,以挖掘出斑馬魚皮膚免疫早期相關功能基因的詳實數(shù)據(jù)信息,

2、為研究魚類皮膚黏膜的免疫機制和研發(fā)浸泡免疫疫苗奠定基礎。
　　首先,從草魚腸道分離鑒定致病性產(chǎn)色葡萄球菌,為后續(xù)試驗提供菌種。采用常規(guī)細菌分離培養(yǎng)方法結合人工感染試驗從草魚腸黏膜分離獲得一株致病菌,命名為SC1菌株。根據(jù)其染色特性和菌落特征進行初步鑒定;然后采用分子生物學方法,對其16SrRNA基因和過氧化氫酶基因(kat)進行擴增和序列分析。結果表明,該菌為G+球菌,呈葡萄串狀排列,無莢膜和芽孢,其生化特性等與葡萄球菌屬(Sta

3、phylococcus)相吻合,分離菌株16SrRNA基因和kat基因PCR擴增產(chǎn)物分別為1520bp和1232bp,序列分析分析表明它們在遺傳距離上與產(chǎn)色葡萄球菌(Staphylococcus chromogenes)最為接近,從而SC1菌株為產(chǎn)色葡萄球菌。
　　其次,建立實驗動物斑馬魚的感染模型。以斑馬魚為實驗動物,感染劑量、時間為參數(shù),進行產(chǎn)色葡萄球菌人工感染斑馬魚試驗,通過觀察感染后斑馬魚的發(fā)病死亡情況以及組織病理學變化,

4、確定其最佳感染條件。結果發(fā)現(xiàn)以108CFU/mL菌液濃度浸泡感染10min后斑馬魚的活動狀態(tài)比較一致,出現(xiàn)了游動緩慢和浮頭現(xiàn)象,并且死亡時間相對較為集中。病理學變化主要表現(xiàn)為腎臟細胞壞死、核內染色質濃縮、染色加深并伴有炎癥細胞浸潤;肝臟細胞排列疏松、染色加深、伴有炎癥細胞浸潤。由此可見,該感染條件是產(chǎn)色葡萄球菌人工感染斑馬魚的最佳條件。
　　最后,以斑馬魚感染模型為研究對象,利用基因芯片技術從皮膚組織中抽提總RNA,經(jīng)生物素(Bi

5、otin)標記后,與包含15617個cDNA探針的斑馬魚表達譜基因芯片雜交,在斑馬魚免疫應答早期,檢測皮膚免疫相關差異表達基因,并進行功能聚類、注釋分析和通路分析。結果共檢測出272個差異表達基因,其中210個為上調表達基因,62個下調表達基因。利用NCBI、MAS等數(shù)據(jù)庫對差異基因進行功能聚類和注釋分析,結果顯示272個差異表達基因中,134個為已知功能基因,具有免疫功能的基因有10個,主要包括凝集素基因(lgals1l3)、組織相容

6、性復合體(mhc1uea、mhc1ufa)、谷胱甘肽氧化物酶基因(gpx1b)、轉鐵蛋白基因(tfa)、凝血因子(f5)、硒蛋白基因(sepw2b)、補體(cfb)(均為上調表達);腫瘤壞死因子基因(tnfsf10l4)和卵黃蛋白原基因(vtg3)(均為下調表達)。它們涉及的免疫反應包括病原體識別、抗原加工與提呈、補體激活和特異性免疫應答。通路分析結果顯示p53信號通路、ErbB受體信號轉導通路和JAK-STAT信號轉導通路等9個通路均