利用dsRNA誘導(dǎo)蚜蟲傳毒相關(guān)蛋白基因沉默以阻斷馬鈴薯Y病毒傳播的研究.pdf

1、大部分植物病毒通過與其傳播介體互作而實現(xiàn)水平傳播。煙蚜(Myzuspersicae)RPS2蛋白是一種核糖體蛋白，研究證實，RPS2在煙蚜傳播馬鈴薯Y病毒時起了重要作用。
　　 利用GenBank查找已報道的煙蚜RPS2蛋白序列，進而得到煙蚜RPS2基因序列，根據(jù)實驗?zāi)康脑O(shè)計引物，通過RT-PCR技術(shù)，擴增得到了煙蚜RPS2基因的cDNA全長序列。將煙蚜RPS2基因的cDNA全長序列連接到PGEM-TeasyVector上并轉(zhuǎn)入

2、大腸桿菌(E.coli)NM522菌株中擴增并保存，再以RPS2基因的cDNA全長序列為模板，分別設(shè)計用于擴增RPS2基因全長序列的前段、中段和末段三個不同片段的引物，PCR擴增得到三段RPS2基因的部分片段，分別命名為RPS2-1、RPS2-2和RPS2-3。同時為了構(gòu)建載體在三個片段兩端分別引入不同的酶切位點，RPS2-1片段的5'端和3'端分別引入了EcoRI和HindⅢ兩個限制性內(nèi)切酶位點，而RPS2-2和RPS2-3兩個片段的

3、5'端和3'端分別引入了EcoRI和BamHI兩個限制性內(nèi)切酶位點。通過酶切、連接等常用的分子實驗方法，將三個片段分別連接到LITMUS-28i質(zhì)粒上，構(gòu)建成三個含RPS2基因片段的dsRNA原核表達載體。載體通過PCR，酶切以及測序等方法進行驗證，結(jié)果表明構(gòu)建的重組載體與預(yù)期相同。
　　 將三種重組載體分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌(E.coli)HT115(DE3)菌株內(nèi)，由于LITMUS-28i質(zhì)粒上存在兩個反向的T7啟動子，同時大腸