枯草芽孢桿菌生物膜在青枯病生防中的功能研究及CycliC-di-GMP信號通路初探.pdf

1、枯草芽孢桿菌與其他芽孢桿菌屬菌株是農業(yè)上生防農業(yè)病蟲害的重要生防菌之一，但其具體生防機理尚未清晰?？莶菅挎邨U菌生防植物病害的主效基因是什么？枯草芽孢桿菌生防菌施用后，以什么細胞形態(tài)存在于植物根圍區(qū)？枯草芽孢桿菌如何調控移動相關基因的表達，游動至植物根圍？枯草芽孢桿菌與寄主植物直接是否存在信號交流？如若存在信號交流，那么該途徑中的信號分子是什么？枯草芽孢桿菌如何接受來自寄主植物的信號分子并調控生防相關基因的表達？等等，這些關于枯草芽孢桿菌

2、生防機理深層次問題的解決，將能更好更有效使用以枯草芽孢桿菌為主要成分的生物農藥，推動枯草芽孢桿菌的產業(yè)化。
　　本研究以生防枯草芽孢桿菌防治番茄青枯病為模型，系統(tǒng)研究了枯草芽孢桿菌生防番茄青枯病的機理，發(fā)現(xiàn)生物膜形成能力和其抗生物質（主要為表面活性素）在生防青枯病中起主效作用。番茄根系分泌物通過激活枯草芽孢桿菌組氨酸激酶KinD，誘導生物膜的形成。研究還首次報道枯草芽孢桿菌C-di-GMP信號途徑調控細胞移動性和生物膜形成，為研究

3、C-di-GMP途徑在枯草芽孢桿菌與寄主植物互作過程的信號交流奠定基礎。
　　1.生防枯草芽孢桿菌生物膜、拮抗能力與防治番茄青枯病相關性研究
　　本試驗以生防枯草芽孢桿菌防治番茄青枯病為模型，系統(tǒng)研究了枯草芽孢桿菌生物膜形成能力和其抗生物質（主要為表面活性素）在其生防青枯病中的作用。首先，從自然界根圍土中分離篩選得到60株芽孢桿菌菌株，通過16SrDNA測序鑒定其中20株為枯草芽孢桿菌。通過溫室防治青枯病試驗選取其中防效高于

4、50％的6菌株進行后續(xù)生防機理研究。野生型菌株都能形成生物膜，試驗構建了生物膜增強和減弱突變體并比較突變體溫室生防青枯病效果。結果表明，枯草芽孢桿菌生物膜能增加生防菌在根圍的定殖能力，其生物膜形成能力與生防活性呈正相關?？股镔|也是生防枯草芽孢桿菌的生防機理之一。本研究構建了不同抗生基因的突變體，通過乎板拮抗試驗和溫室防病試驗發(fā)現(xiàn)表面活性劑在抑制青枯菌過程中起重要作用。本研究結果表明，生物膜形成能力和表面活性劑的產生能力是生防枯草芽孢桿

5、菌防治番茄青枯病的重要機理。研究中建立的番茄-枯草芽孢桿菌體系為研究生防菌-寄主植物互作提供基礎。
　　2.枯草芽孢桿菌組氨酸激酶KinD在寄主植物-枯草芽孢桿菌信號交流過程中功能研究
　　生防枯草芽孢桿菌能夠在植物根部及根圍形成生物膜并在防病促生過程中起著重要作用。但是，對于枯草芽孢桿菌與寄主植物這種友好的互作過程中的諸多細節(jié)報道較少。在互作過程中，枯草芽孢桿菌如何移動至根表并定殖？寄主植物釋放的信號分子是什么？枯草芽孢桿

6、菌如何接受來自植物的信號分子并啟動生物膜相關基因的表達繼而在根表形成生物膜保護寄主免受病原物的侵染？本研究通過建立一種基于無菌培養(yǎng)番茄植株與枯草芽孢桿菌共培養(yǎng)的互作體系來研究兩者之間的互作過程，研究結果發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌通過跨膜的紐氨酸激酶KinD接受植物釋放的信號分子，并通過構建氨基酸點突變體，發(fā)現(xiàn)KinD蛋白結構中CACHE功能域為信號分子的結合位點。番茄的根系分泌物能夠誘導Bacillussubtilis生物膜基因和KinD報道基因

7、sdp的表達。通過分離鑒定根系分泌物，并以KinD報道基因PsdpA-lux活性為篩選指標，發(fā)現(xiàn)根系分泌物中含有1種以上的活性物質能夠增加PsdpA-lux活性，其中L-蘋果酸(L-MalicAcid)分子能夠通過增強KinD的活性，并增加生物膜的形成。
　　3.枯草芽孢桿菌C-di-GMP信號通路基因鑒定及其機制分析
　　C-di-GMP分子廣泛存在于細菌中，作為細菌的第二信使分子，其參與調節(jié)細菌游動性、生物膜形成、寄主表

8、面定殖能力、致病性及細胞間信號交流等多種生理過程。已報道的關于C-di-GMP分子的信號通路研究主要集中于革蘭氏陰性細菌，而革蘭氏陽性細菌的報道甚少。本研究首次對革蘭氏陽性細菌模式菌枯草芽孢桿菌C-di-GMP信號通路的基因進行分析，并初步探明C-di-GMP信號通路在枯草芽孢桿菌移動性及生物膜形成過程中的作用。試驗結果表明，受SpoOA負調控的YuxH蛋白為磷酸二酯酶能夠降解細胞體內的C-di-GMP分子。C-di-GMP分子受體蛋白

9、YpfA與C-di-GMP分子結合后發(fā)生構象變化并直接與細菌鞭毛動力蛋白MotA互作來調控細胞的游動性。C-di-GMP信號通路直接或間接地影響枯草芽孢桿菌生物膜的形成及降解過程。
　　4.總結
　　本研究的主要研究結果與創(chuàng)新點如下:1.從自然界中篩選得到的野生型枯草芽孢桿菌都能形成生物膜，且在各菌株中生物膜形成主要途徑是保守的;2.構建了枯草芽孢桿菌-番茄的互作體系，通過比較野生型菌株及對應生物膜突變體的生防青枯病效果，首