應(yīng)用MBD1檢測全基因組DNA甲基化方法的建立及雞FTO蛋白的的原核表達(dá)、純化和多克隆抗體制備.pdf

1、DNA甲基化是哺乳動物最重要的表觀遺傳學(xué)修飾之一。全基因組DNA甲基化水平的改變與胚胎發(fā)育、癌癥發(fā)生等生理或病理過程密切相關(guān)?，F(xiàn)有的甲基化水平檢測方法都存在一定的缺陷，如DNA甲基容受性測定法靈敏性較低;高效液相色譜法操作繁瑣，過程復(fù)雜;焦磷酸測序只能針對已知序列的特定片段進(jìn)行檢測。此外，許多方法只有在將DNA變性為單鏈后才可進(jìn)行。甲基化CpG結(jié)合蛋白家族(methyl-CpGbinding domain protein，MBD)中的M

2、BD1，MBD2，MBD3，MBD4和MeCP2可以特異性識別天然雙鏈DNA的甲基化。本試驗(yàn)應(yīng)用MBD1重組蛋白建立一種可以快速、簡便地檢測全基因組DNA甲基化水平的半定量方法。
　　 1 MBD1檢測全基因組DNA甲基化水平的方法的建立
　　 首先通過細(xì)菌原核表達(dá)得到MBD1重組蛋白:將重組質(zhì)粒pET30b+-MBD1轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌BL21(DE3)后接種于LB培養(yǎng)基中，異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，表

3、達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA親和層析純化，柱上復(fù)性后洗脫。純化效果通過SDS-PAGE鑒定。采用MBD1檢測全基因組DNA甲基化水平方法流程大致如下:將DNA經(jīng)狹縫轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，用MBD1孵育，再與HisProbe-HRP反應(yīng)，最后采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測。方法的特異性檢驗(yàn):將經(jīng)過或不經(jīng)過體外甲基化處理的細(xì)菌Lambda DNA按照不同比例混合，建立甲基化程度從0-100％的標(biāo)準(zhǔn)曲線，甲基化Lambda DNA顯示陽性條帶，未甲基化

4、的Lambda DNA不顯示條帶，條帶亮度與甲基化程度的線性回歸分析證明該方法可以定量地檢測甲基化DNA。最后通過加入不同量的雞腿肌的基因組DNA檢測此方法的靈敏性，結(jié)果顯示該方法最低可以檢測0.5μg的基因組DNA。
　　 2 MBD1檢測全基因組DNA甲基化水平方法的應(yīng)用與評價
　　 運(yùn)用該方法檢測中國豬種（二花臉豬）和外國豬種（長白豬）的DNA甲基化的組織特異性和品種特異性，檢測發(fā)現(xiàn)肌肉的全基因組DNA甲基化程度最

5、高，三種被檢組織基因組DNA甲基化水平二花臉豬均高于大白豬，且在肝臟中差異顯著(P=0.034);母體蛋白限飼對梅山豬子代肝臟全基因組DNA甲基化沒有顯著的影響。此外應(yīng)用該方法檢測了溫氏黃羽肉雞DNA甲基化的組織差異及發(fā)育變化（18胚齡和1日齡），結(jié)果顯示:與18胚齡相比，1日齡的溫氏黃羽肉雞肝臟、腎、小腸和腿肌四種組織基因組DNA甲基化水平都呈下降趨勢，其中腎的全基因組DNA甲基化水平顯著下降(P=0.05)。18胚齡時，腎的DNA甲

6、基化水平顯著高于肝臟。最后，應(yīng)用商品化的5甲基胞嘧啶抗體檢測1日齡雞DNA甲基化水平的組織差異，驗(yàn)證了本試驗(yàn)所建立方法的準(zhǔn)確性。
　　 3雞FTO蛋白原核表達(dá)、純化與多克隆抗體制備
　　 全基因組關(guān)聯(lián)分析證明FTO基因（fat mass and obesity-associated gene）在不同人群中與肥胖和能量代謝密切相關(guān)。本試驗(yàn)室的研究表明，F(xiàn)TO基因在雞的下丘腦、肝臟、內(nèi)臟脂肪和小腦均有較高的表達(dá)。但是由于缺乏

7、禽類特異性的FTO抗體，對雞FTO蛋白的功能研究受到阻礙。本部分試驗(yàn)旨在制備雞FTO的多克隆抗體。首先以雞的FTO基因序列(NM_001185147)設(shè)計引物，擴(kuò)增得到的產(chǎn)物經(jīng)測序驗(yàn)證后插入表達(dá)質(zhì)粒pColdI，得到重組表達(dá)質(zhì)粒pColdI-FTO;將pColdI-FTO轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌BL21(DE3)后接種于LB培養(yǎng)基中，IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，得到雞的FTO重組蛋白，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Ni-NTA親和層析純化，洗脫后通過SDS-PAGE鑒定

8、。以純化后的雞FTO重組蛋白為抗原，免疫新西蘭白兔制備多抗血清。ELISA檢測所得抗血清效價為1∶51200，Westernblot鑒定其具有良好的特異性。使用所得到的雞FTO蛋白多克隆抗體，對白羽肉雞的下丘腦、腎臟、肝臟、腿肌、脾和卵巢的組織蛋白進(jìn)行Western blot分析，60 kD左右的位置均檢測出條帶，與預(yù)期一致。此外，在42 kD、33 kD和27 kD左右的位置也觀察到條帶，分別代表幾種不同分子量的FTO蛋白異構(gòu)體，并且