短短芽胞桿菌(Brevibacillus brevis)對龍眼保鮮機理的研究.pdf

1、本研究通過分析龍眼果實采后腐爛過程相關酶系的變化規(guī)律，探討龍眼褐變和腐爛的機理，并篩選了龍眼保鮮微生物，研究了該保鮮微生物的生物學特性和保鮮機理，制備了龍眼微生物保鮮菌劑。主要研究結果如下：
　　 1龍眼保鮮微生物的篩選及相關生物學特性分析
　　 從本實驗室已有菌種庫中篩選到6株對龍眼腐生真菌和細菌均具有較好拮抗作用的菌株，其中短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX(Brevibacillus breivs FJAT-0

2、809-GLX)對龍眼腐生細菌和真菌的抑菌效果最好，抑菌圈直徑為15.87 mm，抑菌帶為6.27 mm。對短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX培養(yǎng)條件的研究表明，該菌株培養(yǎng)的最適條件為：轉(zhuǎn)速180 rpm、pH值7.0的培養(yǎng)基、250 mL三角瓶裝瓶量20-40 mL、培養(yǎng)48 h。對短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX的全基因組測序初步分析表明，該菌株的基因組規(guī)模為6 Mb，預測得到5666個基因，平均長度為933 bp，基因密

3、度達到87.83％，基因組的GC含量為47.30％，具有177個菌株特異基因，這些基因的功能如何還有待于進一步的分析。
　　 2龍眼果實致腐機理的分析
　　 從細胞形態(tài)上看，龍眼外果皮結構未發(fā)生明顯的變化，但內(nèi)果皮細胞結構變化比較明顯，從2級果實開始，內(nèi)果皮開始發(fā)生破裂，4級和5級果實的內(nèi)果皮細胞骨架完全發(fā)生瓦解，內(nèi)果皮完全腐爛，有的部位還可以看到菌絲。綜合龍眼果肉和果皮的腐爛特征，將龍眼果實劃分為6個腐爛等級。

4、　　 隨著腐爛程度的加深，龍眼果實的呼吸速率加快，0級龍眼果實呼吸速率為61.17mg/kg hr，4級的龍眼果實呼吸速率達到最大為382.71 mg/kg hr。龍眼果實過氧化物酶(Peroxidase，POD)和多酚氧化酶(Polphenol oxidase，PPO)活性隨腐爛程度加深也增高，腐爛程度達到5級的果皮POD酶活性最高，為15625 U/min g，腐爛程度達到4級的龍眼果皮PPO酶活性最高，為687.5 U/min

5、g。而可溶性固形物(Total soluble solids，TSS)含量隨腐爛程度加深卻呈現(xiàn)降低的趨勢。
　　 龍眼果實腐生細菌和真菌的分離和鑒定結果表明，爛果的真菌和細菌數(shù)量和種類均多于好果。腐生細菌主要包括藤黃微球菌(Micrococcus lutens)、科氏葡萄球菌(Staphylococus cohnii)、短芽胞桿菌(Brevibacillus choshinensis)和多粘類芽胞桿菌(Paenibacillus

6、 polymyxa)；腐生真菌主要包括粉紅聚端孢菌(Trichothecium roseum)和Neofusicoccum parvum。從龍眼果實腐生細菌和真菌的鑒定結果看，未分離到龍眼果實采后病原菌，說明采后病原菌的侵染不是龍眼果實腐爛的主要因素。
　　 3短短芽胞桿菌主要功能成分分析
　　 對短短芽孢桿菌FJAT-0809-GLX活性物質(zhì)提取方法優(yōu)化的結果表明，采用大孔樹脂法和氯仿萃取法這2種方法提取的短短芽胞桿菌

7、FJAT-0809-GLX活性物質(zhì)的得率和抑菌效果有所不同，大孔樹脂法提取的物質(zhì)得率較高，為1.593 g/L，抑菌效果也最好，抑菌圈直徑為27.33 mm。進一步對大孔樹脂提取法各因素的優(yōu)化表明，短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX活性物質(zhì)收集的最佳方案為：將短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX發(fā)酵液常溫3600 rpm離心30 min，取上清液，按比例與40 g/L大孔樹脂AmberliteXADl6混合，28℃，160 rpm

8、振蕩4 h后，填柱，并用水洗柱后，采用3倍洗脫體積的丙酮洗脫，收集丙酮洗脫液，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進行濃縮，所得物質(zhì)即為短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX活性物質(zhì)。
　　 短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX活性物質(zhì)溶于二甲基亞砜、超純水，不溶于石油醚。隨著處理溫度的升高，短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX活性物質(zhì)的抑菌圈直徑逐漸減小，在100℃條件下，抑菌圈直徑最小，為18.17 mm。在100℃條件下處理0 h、2 h、

9、4 h和6 h后，其抑菌效果逐漸降低，抑菌圈直徑分別為20.47 mm、16.67 mm、15.42 mm和13.39 mm。隨著pH值的增大，活性物質(zhì)的抑菌活性有所降低，當pH=7.0時，抑菌圈直徑為20.52 mm，當pH=11.0時，抑菌圈直徑為18.46 mm。短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX活性物質(zhì)對青枯雷爾氏菌、尖孢鐮刀菌、串珠鐮刀菌、茄形鐮孢菌、蘋果樹腐爛病菌和蘋果輪紋病菌等6種植物病原真菌都具有較強的抑制作用，對大

10、腸桿菌K88和沙門氏菌ATCC14028這2種動物病原菌也具有一定的抑制作用，對大腸桿菌K88的抑菌效價為29.22 U/mL。
　　 短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX活性物質(zhì)在三氯甲烷、丙酮、乙醇和甲醇這4種不同有機溶劑中的共有功能成分包括10種，分別為鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯、雙氫麥角胺、羥苯乙酯、鄰苯二甲酸二丁酯、綿馬次酸、3-異丁基-六氫吡咯[1，2-a]吡嗪-1，4-二酮、二乙基二硫代磷酸、3-苯甲基-六氫

11、吡咯[1，2-a]吡嗪-1，4-二酮、4-(乙酰苯基)苯甲烷和尼泊金丙酯。其中，羥苯乙酯和鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯的相對含量較高，對大腸桿菌K88都具有抑菌效果。羥苯乙酯的抑菌效果最好，與硫酸鏈霉素(5 U/mL)的抑菌效果相差不大(P<0.05)，抑菌圈直徑為17.81±0.28 mm，最低抑菌濃度為1.57 mg/mL，推測羥苯乙酯是其主要的抑菌功能成分。
　　 4短短芽胞桿菌保鮮機理的分析
　　 短短芽胞桿菌

12、FJAT-0809-GLX活性物質(zhì)對龍眼果實、鮮切蘋果和臺灣大青棗都具有很好的保鮮效果，對龍眼果實的保鮮率為87.50％，并且可以防止腐生菌的侵染，保持果實色澤，維持可溶性固形物的含量，保持果實的風味。
　　 短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX功能成分對龍眼果實腐生真菌和細菌抑菌能力有所不同。羥苯乙酯對腐生真菌和細菌的抑菌能力最大，抑菌圈直徑在18.41 mm-31.06 mm之間。
　　 短短芽胞桿菌FJAT-08

13、09-GLX活性物質(zhì)對龍眼果皮POD酶活性具有一定的抑制作用，當其濃度為150 mg/mL時，抑制率最高，為9.57％。對其功能成分的抑制作用分析表明，在其中起主要作用的為羥苯乙酯，當其為50 mg/mL時，對龍眼果皮POD酶活力抑制率為25.69％，其次為麥芽酚和苯酚。不同濃度短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX活性物質(zhì)對二苯代苦昧?；杂苫?DPPH·)均具有一定的清除作用，且在一定范圍內(nèi)短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX活性

14、物質(zhì)清除自由基的能力與其濃度呈明顯的量效關系，當其濃度為100mg/mL時，對DPPH·的清除能力最強，清除率最高為61.35％。在其中起主要清除作用的功能成分為麥芽酚，當其濃度為200 mg/mL時，清除率最高為68.35％。不同濃度短短芽胞桿菌FJAT-0809-GLX活性物質(zhì)對羥基自由基(OH)的清除率也有所不同，其中以7.5mg/mL時的清除率最高，達到98.20％，在其中起主要清除作用的成分為羥苯乙酯，當其濃度為150 mg/

15、mL時的清除率最高，達到68.38％。
　　 5龍眼保鮮菌劑的研究
　　 將2‰瓊脂和2-5％的NaCl添加到龍眼保鮮菌發(fā)酵液中制備成龍眼保鮮菌劑，其活菌含量較高，膠懸劑效果最好，質(zhì)地均勻，無上下分層。
　　 龍眼保鮮菌劑對龍眼果實具有較好的保鮮效果，常溫條件下(溫度28-32℃，濕度50-70％)貯藏5 d，龍眼保鮮菌劑處理的腐爛率低于對照，僅為32.67±1.20％，對“早鐘六號”和“解放鐘”枇杷果實也具有較