牙鲆微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選和美洲牡蠣抗病相關(guān)基因SNP的初步分析.pdf

1、1.牙鲆微衛(wèi)星分子標(biāo)記的篩選和鑒定
　　 本研究利用基因組文庫-菌落原位雜交法、構(gòu)建微衛(wèi)星富集文庫法和利用公共數(shù)據(jù)庫EST序列分析法篩選牙鲆微衛(wèi)星標(biāo)記。
　　 1.文庫構(gòu)建法篩選微衛(wèi)星
　　 構(gòu)建了牙鲆基因組文庫,通過菌落原位雜交和測序獲得牙鲆微衛(wèi)星序列20個,篩選出具有多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記8個。通過構(gòu)建微衛(wèi)星富集文庫和菌落原位雜交法獲得陽性克隆350個,測序結(jié)果顯示其中253個克隆含299個微衛(wèi)星序列,其中設(shè)計了

2、173對引物,有131對引物能擴(kuò)增出預(yù)期產(chǎn)物,有60對引物的擴(kuò)增產(chǎn)物呈現(xiàn)多態(tài)性。選取從基因組文庫中獲得的8個多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記和從富集文庫獲得的38個多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記,利用30個野生牙鲆個體對其進(jìn)行多態(tài)性評價,結(jié)果顯示,46個微衛(wèi)星的擴(kuò)增等位基因數(shù)目從4到22個不等,平均等位基因數(shù)目為14.3,觀測雜合度和期望雜合度的范圍分別為0.3285～0.9655和0.3854～0.9732,多態(tài)信息含量PIC平均值為0.79。
　　 2.

3、數(shù)據(jù)庫分析法篩選微衛(wèi)星
　　 利用公共數(shù)據(jù)庫分析從牙鲆EST庫篩查含有微衛(wèi)星的序列,分析了GenBank數(shù)據(jù)庫中包含的牙鲆EST序列(截止2010年2月達(dá)11111個),其中751EST序列含有微衛(wèi)星序列882個,占分析EST總數(shù)的6.76％,其中,二堿基、三堿基、四堿基、五堿基、和六堿基重復(fù)序列分別為444條、254條、53條、95條和40條。選擇了10條含有二堿基重復(fù)且側(cè)翼序列合適的微衛(wèi)星序列設(shè)計引物,并進(jìn)行引物的優(yōu)化和多態(tài)

4、性的檢測,有8個位點具有多態(tài)性,其等位基因數(shù)目為6-12,平均為8.88,觀測和期望雜合度分別為0.3103-0.8346和0.7272-0.8736,多態(tài)信息含量PIC平均值為0.8。在這微衛(wèi)星篩選方法中,EST庫篩查法是最簡便,而且最省人力物力的,另外,構(gòu)建微衛(wèi)星富集文庫法由于其富集率較高達(dá)到80％,相比較基因組文庫法其效率有很大的提高,是大量標(biāo)記中實現(xiàn)高效低耗的較好選擇。
　　 Ⅱ.美洲牡蠣抗病相關(guān)候選基因的單核苷酸多態(tài)性

5、分析
　　 選用美洲牡蠣免疫相關(guān)的大防御素基因(CvBD)和絲氨酸蛋白酶抑制因子 1(CvSerpinl),通過重測序的方法,在兩個基因中探尋單核苷酸多態(tài)(SNP)位點,同時選取部分SNP位點,利用高分辨率溶解曲線技術(shù)在美洲牡蠣不同地理群體和感染疾病死亡前后選育家系中進(jìn)行檢測,分析CvBD,CvSerpinl基因的SNP位點與美洲牡蠣感染帕金蟲和尼氏單孢子蟲的死亡相關(guān)性。
　　 1.CvSerpSnl基因的單核苷酸多態(tài)性

6、分析
　　 為鑒定牡蠣CvSerpinl基因(絲氨酸蛋白酶抑制因子1基因)與美洲牡蠣感染疾病死亡相關(guān)的SNP標(biāo)記,我們使用來自不同地理群體的30個牡蠣樣本,PCR擴(kuò)增基因全長并重測序其cDNA外顯子,利用軟件對其序列進(jìn)行分析,獲得了14個SNP位點,均位于編碼區(qū),其中同義突變5個,非同義突變9個。同時利用不同地理群體和死亡前后選育家系樣本,選擇3個SNP位點,使用高分辨率溶解曲線技術(shù)進(jìn)行SNP檢測和分型,結(jié)果顯示只有一個SNP位

7、點CvSPI224(A-C)在群體和家系內(nèi)均具多態(tài)性,且符合哈迪溫伯格平衡。檢測結(jié)果在美國北方(馬塞諸塞州、新澤西州)和南方群體(佛羅里達(dá)州、德克薩斯州)之間具有顯著差異,推測差異來源于地理隔離。同時在德克薩斯州和佛羅里達(dá)州群體之間檢測結(jié)果也存在明顯差異,推測存在差異的原因可能與兩地疾病嚴(yán)重程度不同有關(guān)。家系間的分析結(jié)果表明此位點在死亡前后家系間存在顯著差異,這意味著CvSPI224位點多態(tài)性可能同美洲牡蠣抵抗夏季MSX、Dermo病原

8、感染有著一定的相關(guān)性。此結(jié)果同LaPeyre等人利用CvSerpinl基因進(jìn)行的基因表達(dá)和感染實驗相一致。
　　 2.CvBD基因的單核苷酸多態(tài)性分析
　　 為鑒定牡蠣CvBD基因(大防御素基因)與美洲牡蠣感染疾病死亡有關(guān)的SNP標(biāo)記,本實驗使用來自不同地理群體的25個牡蠣樣本,PCR擴(kuò)增基因全長并重測序其CDNA外顯子,對其序列進(jìn)行分析,獲得了25個SNP位點,除一個一個位于5'非翻譯區(qū)外,其余均均位于編碼區(qū)。在所有S

9、NP位點中,同義突變只有2個,非同義突變達(dá)到了23個。SNP位點中極高的NS/S比率揭示此基因可能在進(jìn)化中受到了強(qiáng)烈的陽性選擇。利用與前文一致的樣本,同樣使用高分辨率溶解曲線技術(shù)對其中的3個非同義突變的SNP位點進(jìn)行SNP檢測和分型,其中2個位點結(jié)果在群體和家系內(nèi)均具有多態(tài)性,并有一定的差異。不同地理群體結(jié)果中SNP CvBD378(T-G)僅在南方與北方群體中顯示出顯著的差異,而SNP CvBD90(T-G)位點顯示佛羅里達(dá)群體與其他

10、群體存在明顯差異,同時兩位點在群體中對于哈迪溫伯格平衡存在一定的偏離(P＜0.05)。在感染前后家系分析中沒有觀察到明顯的差異,但在XG3家系中兩位點均發(fā)生了偏離孟德爾遺傳比的情況。推測原因可能與該基因中存在拷貝數(shù)變異(Copy Numbers Variant,CNV)有關(guān),該變異可能影響鄰近的SNP檢測結(jié)果,并使出現(xiàn)連鎖不平衡現(xiàn)象。對于該現(xiàn)象的驗證,需要通過測序和更多的SNP分析來進(jìn)行。
　　 本論文對于海洋生物的分子標(biāo)記篩選

11、以及其在抗病育種中的作用進(jìn)行了初步研究,在牙鲆中利用不同方法獲得了較多的分子標(biāo)記,并對其多態(tài)性進(jìn)行了檢測,為下一步構(gòu)建連鎖圖譜奠定了基礎(chǔ)。對美洲牡蠣疾病候選基因SNP分子標(biāo)記的研究表明,美洲牡蠣絲氨酸蛋白酶抑制因子1基因中的SNP位點CvSPI224 C基因型與美洲牡蠣對夏季大規(guī)模死亡相關(guān)疾病的抗性具有相關(guān)性,提示其可作為與美洲牡蠣抗病相關(guān)的候選分子標(biāo)記應(yīng)用于其抗病育種中,同時為貝類的標(biāo)記輔助育種提供參考。而大防御素基因的抗病相關(guān)分子標(biāo)