煙草和水稻Med8及其它中介體的基因克隆和功能分析.pdf

1、中介體復(fù)合物是真核生物通用轉(zhuǎn)錄裝置的重要組成部分,轉(zhuǎn)錄因子在中介體的協(xié)助下與啟動(dòng)子結(jié)合,從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。迄今為止,對(duì)酵母中介體的結(jié)構(gòu)和功能已研究得比較清楚,對(duì)哺乳動(dòng)物和人中介體的研究也比較深入,但對(duì)植物中介體的研究還相對(duì)滯后。雖然中介體在酵母和多細(xì)胞動(dòng)物以及植物的細(xì)胞中具有很高的結(jié)構(gòu)和功能保守性,但不同物種間仍存在很大的差異。這種差異在一定程度上保持了物種遺傳的穩(wěn)定性與物種變化的多樣性,也是物種進(jìn)化的結(jié)果。
　　 中介體亞基

2、Med8功能的缺失導(dǎo)致酵母溫敏性致死,也導(dǎo)致擬南芥葉片數(shù)增多、開(kāi)花延遲等。這說(shuō)明Med8具有十分重要的功能。在酵母和人類(lèi)細(xì)胞中,Med8的分子機(jī)理已研究得比較清楚,但在植物中還知之甚少。因此,研究植物中Med8的分子機(jī)理十分必要,這不但有助于理解中介體復(fù)合物亞基在真核生物基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用,而且能夠?yàn)樽魑镞z傳改良提供理論依據(jù)。
　　 本研究克隆了煙草和水稻的Med8基因(分別命名為NtMed8和OsMed8),通過(guò)RNA干擾

3、和過(guò)量表達(dá)等方法研究了Med8在煙草和水稻中的功能:通過(guò)定量PCR或Med8啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS基因表達(dá),分析了Med8在煙草和水稻中的時(shí)空表達(dá)模式；通過(guò)構(gòu)建熒光蛋白的融合表達(dá)載體,研究了Med8蛋白的亞細(xì)胞定位；通過(guò)BiFC技術(shù)分析了Med8與其它中介體亞基的相互作用。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.NtMed8基因的克隆與功能研究
　　 利用同源搜索,獲得與擬南芥AtMed8同源的煙草EST序列,以番茄同源基因?yàn)閰⒄招蛄?/p>

4、設(shè)計(jì)引物,克隆了普通煙草NtMed8基因。測(cè)序確定NtMed8編碼序列長(zhǎng)1593 bp,編碼530個(gè)氨基酸。同源搜索比對(duì)發(fā)現(xiàn),Med8在植物中高度保守,分別含有酵母Med8N與Med8C相似序列。定量PCR檢測(cè)野生型煙草,發(fā)現(xiàn)NtMed8在煙草營(yíng)養(yǎng)器官的幼嫩組織和生殖器官里表達(dá)較強(qiáng)。構(gòu)建了RNAi載體并轉(zhuǎn)化煙草。結(jié)果表明,RNAi植株出現(xiàn)諸多異常:葉片數(shù)顯著增加,部分葉片畸形；長(zhǎng)日早花、短日晚花；雄性不育,花粉變大,雖可被KI-I2溶液

5、染色但幾乎不萌發(fā)；葉片表皮細(xì)胞、葉肉細(xì)胞、葉綠體皆變大,氣孔密度下降,花器官變大,等等。
　　 2.煙草和水稻幾個(gè)中介體亞基的亞細(xì)胞定位和表達(dá)譜分析
　　 利用同源搜索和EST序列拼接,克隆了煙草中介體亞基基因NtMed18、NtMed6和NtMed21,構(gòu)建了35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的與增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)和增強(qiáng)型黃色熒光蛋白(EYFP)基因的融合表達(dá)載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。結(jié)果表明

6、,NtMed8、NtMed18、NtMed6和NtMed21定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi),但主要在細(xì)胞核里。同源克隆了水稻中介體亞基基因OsMed6、OsMed8和OsMed22,構(gòu)建了玉米u(yù)biquitin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的EYFP基因的融合表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化煙草葉片進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。結(jié)果表明,OsMed6特異地定位在細(xì)胞核內(nèi)；OsMed8定位在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)內(nèi),但主要在細(xì)胞核內(nèi)；OsMed22特異地在細(xì)胞壁處成段分布,其亞細(xì)胞定位有待于進(jìn)一步確認(rèn)

7、。同時(shí),利用現(xiàn)有的基因芯片數(shù)據(jù),對(duì)水稻23個(gè)推測(cè)的中介體亞基基因在21中組織中的表達(dá)譜進(jìn)行了聚類(lèi)分析。結(jié)果表明,23個(gè)中介體亞基中,OsMed12的表達(dá)組織特異性最強(qiáng),其次為OsMed11,其它21個(gè)亞基基因表達(dá)無(wú)明顯規(guī)律,較接近組成型表達(dá)。OsMed15在檢測(cè)的各個(gè)組織中(除了受精后6天的胚乳)都有較強(qiáng)表達(dá),OsMed10在21個(gè)組織中整體表達(dá)較弱。OsMed12、OsMed11、OsMed28、OsMed31、OsMed17、OsM

8、ed18和OsMed19b是把21個(gè)組織分成4組的過(guò)程中起關(guān)鍵作用的7個(gè)基因。
　　 3.NtMed8與其它亞基的互作分析
　　 為了證實(shí)同源克隆的NtMed8屬于煙草中介體亞基,同時(shí)研究NtMed8與其它亞基的相互作用,構(gòu)建了35S驅(qū)動(dòng)的含有EYFP N-端1-173氨基酸編碼序列標(biāo)簽的融合表達(dá)載體(pNYE和pNeYE)以及含有EYFP C-端151—238氨基酸編碼序列標(biāo)簽的融合表達(dá)載體(pCYE和pCeYE)。把

9、NtMed8、NtMedl8、NtMed6和NtMed21的全長(zhǎng)ORF亞克隆到相應(yīng)的載體上,獲得N端和C端分別含有不同EYFP片段的融合表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后,把不同的菌液1:1混合,共轉(zhuǎn)化煙草葉片,72 h后在共聚焦顯微鏡下觀察熒光。結(jié)果表明,NtMed8與NtMed18存在互作,與酵母中介體亞基的互作關(guān)系一致。同時(shí),還觀察到NtMed8與NtMed6和NtMed21的互作以及NtMed18與NtMed6的互作。
　　 4.O

10、sMed8功能的初步研究
　　 為了研究Med8在水稻中的時(shí)空表達(dá)與功能,構(gòu)建了OsMed8啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS表達(dá)載體以及OsMed8的過(guò)量表達(dá)載體和RNAi載體,以農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻品種中花15。結(jié)果表明,在各個(gè)組織都能檢測(cè)到GUS基因的表達(dá),主要在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)較旺盛的部位染色較強(qiáng),包括側(cè)根原基、子房和雌蕊基部、初分化的小穗、幼嫩莖等。過(guò)量表達(dá)OsMed8導(dǎo)致水稻早花、稻穗變長(zhǎng)、穗粒數(shù)增多,而RNA干擾則導(dǎo)致水稻晚花、