RNAi介導(dǎo)CatSper2沉默調(diào)控雄性大鼠受精能力的研究.pdf

1、精子超活化運動是精子獲能和發(fā)生頂體反應(yīng)的一個重要生理前提，其賦予精子強有力運動，使其逃離輸卵管上皮“誘捕”，成功穿越透明帶與卵子結(jié)合完成受精。先前的研究包括本課題組已經(jīng)證實，在眾多質(zhì)膜離子通道中，Cation channel of sperm(CaSper)蛋白家族所介導(dǎo)的Ca2+直接參與精子超活化的調(diào)控過程。作為介導(dǎo)Ca2+專一性通道蛋白，CatSper蛋白家族與精子超活化和受精力直接相關(guān)[62,63]，且其專一性表達于睪丸和成熟的精

2、子。過去的幾年中，對于對CatSper家族的研究主要是集中于對其功能的探討，尚未見以其為靶點進行雄性生殖調(diào)控的研究，可以預(yù)見在現(xiàn)有對CatSper家族蛋白研究基礎(chǔ)上，抑制或敲減CatSper家族蛋白某個亞基的表達，探討雄性生殖調(diào)控的最佳靶點將成為未來CatSper家族蛋白研究的重點，
　　 本研究針對大鼠CatSper蛋白家族的一個亞基CatSper2構(gòu)建質(zhì)粒載體和病毒載體，借助睪丸網(wǎng)微注射和活體電轉(zhuǎn)等措施轉(zhuǎn)染大鼠睪丸，以期通過

3、阻斷大鼠精子胞外Ca2+峰，抑制精子超活化過程，而實現(xiàn)對雄性生殖調(diào)控的目的。研究中，分別利用小動物活體成像系統(tǒng)、熒光解剖鏡、FCM、CASA、Q-PCR、Westem-blot、激光共聚焦顯微鏡、IVF和組織學(xué)分析等手段，對活體干涉后大鼠睪丸組織和附睪精子的轉(zhuǎn)染效率、精子超活化運動、CatSper2表達敲減率、精子胞內(nèi)Ca2+震蕩波、精子受精能力、體外存活時間，以及睪丸網(wǎng)微注射和活體電轉(zhuǎn)等可能對睪丸功能和精子生理機能產(chǎn)生的影響等問題分別

4、進行了系統(tǒng)分析。
　　 主要研究結(jié)果如下:
　　 1.成功構(gòu)建了大鼠CatSper2基因的質(zhì)粒載體和病毒載體，并在大鼠活體睪丸實現(xiàn)了高效轉(zhuǎn)染和表達;
　　 根據(jù)體外電穿孔介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染精子篩選出的最佳干涉序列，實驗成功構(gòu)建了CatSper2基因質(zhì)粒載體和病毒載體，并借助睪丸網(wǎng)微注射和活體電轉(zhuǎn)的手段在大鼠活體獲得了良好轉(zhuǎn)染和高效表達效果。相比于病毒載體的持續(xù)穩(wěn)定表達，質(zhì)粒載體結(jié)合活體電轉(zhuǎn)的方法在對CatSper

5、2基因的敲減方面更加有優(yōu)勢。反過來，就轉(zhuǎn)染后大鼠附睪陽性精子率來講，盡管質(zhì)粒載體組87.75％略高于病毒組的83.3％（P＞0.05），但在轉(zhuǎn)染后第60d獲得附睪陽性精子率，病毒組的78.7％略高于質(zhì)粒組的77.75％(P＞0.05)，并且在兩者對CatSper2蛋白的敲減持續(xù)性方面，病毒組同樣優(yōu)于質(zhì)粒組。這表明病毒重組質(zhì)粒能夠?qū)λ拗骷毎@得更好的整合性。但是兩者之間的這些數(shù)據(jù)之間并不具有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 2、生理狀態(tài)下，質(zhì)粒

6、載體和病毒載體對睪丸的轉(zhuǎn)染和表達效率存在強的濃度和時間依賴性;
　　 通過小動物活體成像系統(tǒng)和熒光解剖鏡的分析可以知道，隨著質(zhì)粒載體（25μg～50μg）和病毒載體（10μl～40μl）注射劑量的增大，睪丸表面所捕獲的GFP熒光信號及觀察到熒光表達逐漸增強，呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性，注射50μg質(zhì)粒載體和40μl病毒液時獲得了最強的GFP表達信號。但在對數(shù)據(jù)分析后表明，對于質(zhì)粒載體注射45μg和50μg睪丸GFP信號強度并沒有顯著差

7、異(P＞0.05);在病毒轉(zhuǎn)染組注射35μl和40μl病毒液時兩者睪丸GFP表達也沒有統(tǒng)計學(xué)差異，為了獲得更好的實驗結(jié)果，后續(xù)的實驗中均以注射45μg質(zhì)粒載體和35μl病毒載體進行相關(guān)的研究;從實驗的結(jié)果知道，當(dāng)注射同等劑量的質(zhì)粒載體和病毒液時，兩者轉(zhuǎn)染效率同樣存在顯著的時間依賴性，質(zhì)粒載體和病毒載體對睪九組織和附睪精子CatSper2表達敲減的峰值均出現(xiàn)在了轉(zhuǎn)染后第13天和第22天。
　　 3、活體干涉后大鼠附睪精子CASA分

8、析顯示，精子胞內(nèi)儲存Ca2+足夠起始超活化過程，但沒有胞外峰的支持，超活化過程將無法維持;
　　 當(dāng)應(yīng)用50μM thimerosal處理大鼠的精子時，無論胞外環(huán)境中是否存在Ca2+，90％以上的處理組和對照組精子都能夠發(fā)生超活化過程，只不過這一過程非常短暫;之后如果將精子在含有5 mM procaine獲能液中孵育5 min，相比于對照組90％以上的精子再次獲得超活化不同，干涉處理組精子卻因為質(zhì)膜上沒有更多的CatSper2通

9、道蛋白響應(yīng)procaine的激活，無法介導(dǎo)更多的Ca2+峰的進入胞質(zhì)，精子細胞內(nèi)持續(xù)處于較低Ca2+濃度的狀態(tài)，這表明盡管細胞內(nèi)儲存Ca2+足夠起始超活化過程，但如果沒有胞外Ca2+峰的有效補充超活化過程將無法得以維持。
　　 4、CatSper2表達敲減后，精子胞內(nèi)Ca2+峰的缺失，使精子喪失穿越透明帶的能力無法完成受精;
　　 體外受精實驗證實，干涉處理組大鼠附睪精子由于缺少一種穿越透明帶的“力量”而不能像對照組一樣

10、使正常卵子受精。相反，以0.4％透明質(zhì)酸酶將透明帶去除后的卵子卻能與干涉處理組精子正常受精，并且受精率并沒有顯著差異;為了更進一步揭示干涉處理組精子無法使正常卵母細胞受精的真正原因，我們又進行粘滯性溶液中精子遷移率的實驗，相對于對照組和Mock組精子前進行性運動下降為正常狀態(tài)的48％，病毒轉(zhuǎn)染處理組精子前進行性幾乎完全被抑制。這也進一步表明阻礙干涉處理組精子無法完成受精的主要原因是，透明帶粘滯性環(huán)境對喪失超活化運動的大鼠精子是最大的障礙

11、。
　　 5、睪丸組織學(xué)和精子體外存活研究證實，睪丸網(wǎng)微注射和活體電轉(zhuǎn)的處理并沒有大鼠睪丸功能和精子本身產(chǎn)生有害影響。
　　 睪丸微注射結(jié)合活體電轉(zhuǎn)介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染睪丸，通過敲減CatSper2基因表達探索雄性生殖調(diào)控的最佳靶點，最重要的是要保證睪丸功能和精子的產(chǎn)生及其功能沒有受到影響。為了證實這些方法可能的副作用，我們對睪丸網(wǎng)微注射和活體電轉(zhuǎn)后大鼠的睪丸組織和精子體外存活率等指標(biāo)進行了分析，從圖4-6結(jié)果知道，隨著轉(zhuǎn)染時間

12、的延長，可以看到不同生長階段的曲細精管上皮細胞表達GFP，這表明注射和電轉(zhuǎn)后，大鼠的精子發(fā)生周期是正常的，并且顯微鏡下并沒有見到明顯的組織損傷和出血點。而精子體外存活能力實驗也證實（圖4-5），與對照組精子相比，處理組精子體外存活能力并沒有受到影響。
　　 CatSper蛋白家族在精子超活化和受精能力方面具有重要的作用，其中任何一個亞基的異常表達不僅導(dǎo)致精子無法獲得超活化，而且失去穿越透明帶的能力。在這個研究中，睪丸網(wǎng)微注射結(jié)合