三疣梭子蟹微衛(wèi)星富集文庫的構(gòu)建及五個(gè)野生地理群的多樣性分析.pdf

1、本文采用富集文庫-菌落原位雜交法構(gòu)建了三疣梭子蟹微衛(wèi)星富集文庫,分離篩選出30對擴(kuò)增條帶清晰穩(wěn)定,多態(tài)性較高的引物,選取其中8對引物對我國由南到北五個(gè)群體(舟山、海州灣、青島即墨會場、萊州灣、鴨綠江口)的野生三疣梭子蟹的遺傳多樣性進(jìn)行了比較分析,對于加快育種進(jìn)程,提高選擇效率具有重要的意義。論文具體內(nèi)容如下:
　　 1、利用富集文庫.菌落原位雜交法篩選三疣梭子蟹微衛(wèi)星標(biāo)記,通過固定了(AC)15和(AG)15探針的尼龍膜(Hyb

2、ond N+)捕捉含有微衛(wèi)星的片段,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a中,構(gòu)建三疣梭子蟹微衛(wèi)星富集文庫。菌落原位雜交后,任意選取150個(gè)克隆進(jìn)行測序,得到124條序列,其中18個(gè)克隆的核心序列重復(fù)數(shù)太少或不含有重復(fù)序列,106個(gè)含重復(fù)序列的克隆中均只含有微衛(wèi)星位點(diǎn),陽性克隆率為85.48％。通過重復(fù)序列篩查去除冗余部分,得到103個(gè)獨(dú)立克隆序列,其中完美型43個(gè),占41.75％;非完美型8個(gè),占7.767％;復(fù)合型52個(gè),占50.48％,共176個(gè)

3、微衛(wèi)星位點(diǎn)。利用軟件共設(shè)計(jì)了105對微衛(wèi)星引物,81對引物能夠得到清晰的預(yù)期長度的擴(kuò)增片段,56對引物表現(xiàn)出多態(tài)性。用30個(gè)野生三疣梭子蟹個(gè)體進(jìn)行遺傳信息評價(jià),結(jié)果顯示30個(gè)位點(diǎn)在該群體中具有較高多態(tài)性。不同的位點(diǎn)獲得的等位基因數(shù)目從3～13個(gè)不等,共獲得238個(gè)等位基因,平均每個(gè)位點(diǎn)獲得8.0個(gè)等位基因,觀測雜合度、期望雜合度及多態(tài)性信息含量值的范圍分0.2222～1.0000、0.4367～0.9099和0.350～0.892,研究

4、結(jié)果表明富集文庫-菌落原位雜交法適合于大規(guī)模篩選目標(biāo)物種的微衛(wèi)星標(biāo)記。
　　 2、選取8對引物對三疣梭子蟹5個(gè)野生地理群體進(jìn)行多樣性分析,結(jié)果顯示,8個(gè)位點(diǎn)在5個(gè)三疣梭子蟹群體的120個(gè)個(gè)體中共擴(kuò)增得到72個(gè)等位基因,不同引物獲得的等位基因數(shù)從6～12不等,平均每個(gè)位點(diǎn)獲得的等位基因數(shù)目為9.0個(gè)。有效等位基因數(shù)在2.9058～7.7901之間,平均每個(gè)位點(diǎn)檢測的有效等位基因數(shù)目為5.4677個(gè)。
　　 3、計(jì)算各位點(diǎn)的

5、多態(tài)信息含量,8個(gè)位點(diǎn)在5個(gè)群體中得到的多態(tài)信息含量有所不同,其中位點(diǎn)PTR112在HZ群體中獲得的多態(tài)信息含量最高為0.8349,而位點(diǎn)PTR103b在HZ群體中的多態(tài)信息含量最低為0.3794。統(tǒng)計(jì)各位點(diǎn)在各群體中的PIC值發(fā)現(xiàn),只有兩個(gè)PIC值低于0.5,屬于中度多態(tài)性位點(diǎn),其他PIC值均大于0.5。從8個(gè)位點(diǎn)在每個(gè)群體中的平均多態(tài)信息含量來看,PIC值從0.6748～0.7138不等,均大于0.5;從各微衛(wèi)星位點(diǎn)的平均多態(tài)信息含

6、量來看,PIC值在0.5394～0.8003之間,同樣都大于0.5,平均多態(tài)信息含量為0.6967。由此可見,所選擇的微衛(wèi)星位點(diǎn)具有豐富的多態(tài)性,能夠在分子水平上很好的反映5個(gè)地理群體間和群體內(nèi)的遺傳關(guān)系。
　　 4、8個(gè)位點(diǎn)在5個(gè)群體中所反映的群體雜合度有較大差異,其中位點(diǎn)PTR45在LZ群體的觀測雜合度最高為0.9167,位點(diǎn)PTR103b在HZ群體的觀測雜合度最低為0.4091。在某一個(gè)群體中的各位點(diǎn)的觀測雜合度也差異較大

7、,表明用單個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行群體雜合度的檢測,其結(jié)果并不一定能夠代表群體的真實(shí)雜合度水平,通常取多個(gè)位點(diǎn)雜合度的平均值。根據(jù)所得的雜合度平均值可知,5個(gè)群體的平均期望雜合度相差不大,以LZ群體的最高He=0.7704,ZS群體的雜合度最低He=0.7283;平均觀測雜合度在0.6481～0.7604之間。觀察5個(gè)群體的觀測雜合度和期望雜合度發(fā)現(xiàn),二者均相差較小,說明每個(gè)群體內(nèi)的等位基因頻率都未偏離HW平衡。通過對5個(gè)群體中各位點(diǎn)的卡方檢驗(yàn)可知,

8、除了LZ群體和HC群體的PTR145位點(diǎn),HZ群體的PTR98a和PTR112位點(diǎn)以及ZS群體的PTR98a和PTR103b位點(diǎn)表現(xiàn)為顯著和極顯著偏離HW平衡外,其余位點(diǎn)均符合HW平衡。
　　 5、通過計(jì)算種群間的遺傳距離和遺傳相似性指數(shù)表明,三疣梭子蟹5個(gè)群體間的遺傳距離在0.2451～0.5179之間,遺傳相似性指數(shù)從0.5958～0.7826,其中HC和HZ的遺傳距離最小,相似性最高,LZ和ZS的遺傳距離最遠(yuǎn),相似性最小。