家蠶類(lèi)胰島素基因BBX-B8的功能研究.pdf

1、胰島素/類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子信號(hào)通路在所有多細(xì)胞有機(jī)體的生長(zhǎng)和發(fā)育，繁殖，抗逆性，新陳代謝和壽命等生物學(xué)方面扮演著重要角色。昆蟲(chóng)類(lèi)胰島素肽（Insulin-like peptides，ILPs）種類(lèi)多樣，在腦和其它組織中由多基因家族編碼并表達(dá)，與脊椎動(dòng)物胰島素結(jié)構(gòu)組成非常相似但功能卻不相同。
　　 家蠶為鱗翅目昆蟲(chóng)的模式種，家蠶蠶素（Bombyxin，BBX）是首次發(fā)現(xiàn)的昆蟲(chóng)類(lèi)胰島素，擁有7個(gè)（A ～G）家族38個(gè)成員，是昆蟲(chóng)ILP

2、s 功能研究的良好材料。家蠶BBXB 族的B8基因（BBX-B8），編碼88個(gè)氨基酸殘基，在家蠶腦神經(jīng)分泌細(xì)胞高水平表達(dá)。業(yè)已明確，家蠶BBX具有促進(jìn)造血器官細(xì)胞增殖、參與糖代謝、調(diào)控蓖麻蠶前胸腺的分泌活性。為進(jìn)一步探討B(tài)BX-B8基因的功能，采用RNAi和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，較系統(tǒng)地研究上調(diào)、下調(diào)BBX-B8表達(dá)水平對(duì)家蠶生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆性、化性、絲蛋白合成等方面的影響。在克隆BBX-B8 cDNA的基礎(chǔ)上，通過(guò)RT-PCR 檢測(cè)到了BBX-B

3、8 在家蠶腦、卵巢、精巢、中腸、前部絲腺、馬氏管、脂肪體和胚胎等組織中有不同程度的表達(dá)，而翅原基、卵黃中未檢測(cè)到BBX-B8的mRNA，表明家蠶BBX-B8的表達(dá)具有組織特異性；Western boltting測(cè)定結(jié)果顯示，5 齡3 d 腦組織中BBX-B8 水平較低，5 d 起明顯上升。將體外轉(zhuǎn)錄合成的BBX-B8dsRNA 腹注5 齡3 d 家蠶，sqRT-PCR和Western boltting 檢測(cè)結(jié)果顯示，注射3 d后腦中BB

4、XmRNA 水平的下降程度依賴于dsRNA的注射劑量，10 μg/頭注射區(qū)腦組織中BBX水平下降約30％。證實(shí)BBX-B8 dsRNA 對(duì)家蠶BBX基因有表達(dá)抑制效應(yīng)。以此BBX-B8 RNAi 家蠶模型對(duì)BBX功能的研究結(jié)果顯示，5 齡3 d 注射BBX-B8 dsRNA，蛹翅原基發(fā)育受阻，畸形翅增多，成蟲(chóng)腦的形態(tài)發(fā)育明顯延緩；注射2 d后進(jìn)行高溫（40 3 h ℃）和低溫（4 3 h ℃）沖擊，化蛹率比對(duì)照區(qū)提高12.76％；注射后

5、禁食處理，饑餓狀態(tài)下的化蛹率比對(duì)照區(qū)低9.29％；注射3 d后，血淋巴中SOD活性、T-AOC分別提高17.81％、41.86％，而CAT活性與對(duì)照無(wú)顯著差異；血淋巴中海藻糖和海藻糖酶的水平分別上升12.68％和68.24％?；?d后的蠶蛹注射BBX-B8 dsRNA(10、15 μg/10 μL·頭），其造卵量分別增加7.86％和12.62％。將家蠶BBX-B8w(野生型）和BBX-B8m(改造型）基因克隆進(jìn)昆蟲(chóng)非轉(zhuǎn)座子載體pIZT

6、/V5-6His中，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因重組載體pIZT/V5-B8w和pIZT/V5-B8m，分別轉(zhuǎn)化家蠶BmN 細(xì)胞，經(jīng)Zeocin 篩選和分子生物學(xué)鑒定獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞B8w和B8m；調(diào)查結(jié)果顯示B8w和B8m的生長(zhǎng)稍慢于正常BmN 細(xì)胞，對(duì)桿狀病毒Bm-BacPAK6的感染性B8w和B8m 與正常BmN 細(xì)胞之間無(wú)明顯差異。采用精子介導(dǎo)法將轉(zhuǎn)基因載體pIZT/V5-B8w 導(dǎo)入家蠶基因組，通過(guò)熒光篩選和分子生物學(xué)方法鑒定獲得了BBX-B8w