茶樹熒光性綠斑病葉中綠色熒光物質(zhì)的提取、純化及檢測方法研究.pdf

1、茶樹（Camellia sinensis（L.）0.Kuntze）熒光性綠斑病是近年來發(fā)現(xiàn)的的一種茶樹成葉生理性病害，病癥表現(xiàn)為葉片下表皮局部凸起呈綠色斑點(diǎn)或斑塊狀，光照下病斑處可見黃綠色熒光。
　　 為了從分子水平上了解熒光性綠斑病葉的發(fā)光機(jī)理，并為研究熒光物質(zhì)在茶樹體內(nèi)生物合成途徑提供分子理論基礎(chǔ)，本課題以熒光性綠斑病葉為材料，在科學(xué)驗證綠色熒光物質(zhì)存在的基礎(chǔ)上，系統(tǒng)研究了綠色熒光物質(zhì)的熒光特性，建立了HPLC分析方法，經(jīng)超

2、聲浸提、聚酰胺固相萃取、中高壓制備色譜純化得到高純度綠色熒光物質(zhì)組分，并根據(jù)綠色熒光物質(zhì)的相關(guān)特性和光譜數(shù)據(jù)對其分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行推測，主要研究結(jié)果如下：
　　 1.科學(xué)地驗證了綠斑病葉熒光現(xiàn)象和綠色熒光物質(zhì)的存在，獲得綠色熒光物質(zhì)的原位熒光光譜；確定綠色熒光物質(zhì)的最大激發(fā)、發(fā)射波長分別為：490 nm和515 nm。
　　 2.綠色熒光物質(zhì)的熒光特性易受溶液pH、緩沖體系、溶劑體系、鈣離子、溫度等因素的影響，其中溶液pH和緩

3、沖體系對熒光強(qiáng)度的影響顯著，在pH=7.4±0.2的Tris-BES緩沖體系中，綠色熒光強(qiáng)度最大；與純水溶劑相比，添加極性有機(jī)溶劑能顯著提高綠色熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度，且乙腈>四氫呋喃>N，N-二甲基甲酰胺>甲醇，有機(jī)溶劑含水50％時，熒光強(qiáng)度達(dá)到最大；Ca2+的熒光增敏效應(yīng)不顯著；浸提過程中加熱處理有利于綠色熒光物質(zhì)的形成。
　　 3.確定綠色熒光物質(zhì)粗品的最佳前處理方法：沸水浸提30min（固液比1:20），期間超聲助溶15 m

4、in，聚酰胺固相萃?。? h），水靜態(tài)解吸（3 h），解吸液經(jīng)旋蒸濃縮后用4倍體積丙酮處理，抽濾，濾液旋蒸濃縮后用乙酸乙酯萃取，水相旋蒸濃縮至干，即得綠色熒光物質(zhì)粗品。
　　 4.建立綠色熒光物質(zhì)的HPLC分析方法：Hypersil Gold aQ C18型色譜柱（4.6×250 mm，5μm）；流動相：A-10mmol/L乙酸銨水溶液，B-甲醇；梯度洗脫：0→5 min，0％B相；5→65min，0％→60％B相；進(jìn)樣量：10

5、μL；流速：0.8 mL/min；柱溫：28℃。該色譜條件適合與多種檢測器（FD、MS、UV、DAD、NMR）聯(lián)用，可用于綠色熒光物質(zhì)色譜峰的特征定位、純度檢測及紫外-可見光譜、質(zhì)譜等分子結(jié)構(gòu)信息的獲取，并為應(yīng)用色譜技術(shù)制備高純度綠色熒光物質(zhì)提供依據(jù)。
　　 5.以制備的熒光物質(zhì)粗品為材料，應(yīng)用中壓液相色譜（ODS BP C18）、制備型HPLC（YMC-Pack ODS AQ）色譜分離純化技術(shù)，首次獲得三種高純度熒光物質(zhì)GFC

6、1、GFC2和GFC3，其中GFC1的光度純度達(dá)到90％以上，為解析分子結(jié)構(gòu)提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 6.三種高純度綠色熒光物質(zhì)的紫外-可見吸收光譜具有很高的相似性，在紫外區(qū)220nm、270 nm、325 nm處有吸收峰，在可見光區(qū)490 nm處有較強(qiáng)吸收峰。應(yīng)用超高分辨質(zhì)譜技術(shù)獲得兩種綠色熒光物質(zhì)GFC1、GFC2的精確分子量分別為287.28387和313.08635。
　　 以上研究成果為茶樹熒光性綠斑病葉中綠色熒