斑馬魚(yú)干擾素抑制ISKNV感染的作用及斑馬魚(yú)IL4-13作用的研究.pdf

1、傳染性脾腎壞死病毒(ISKNV)是細(xì)胞腫大虹彩病毒屬的代表種，它是引起我國(guó)養(yǎng)殖鱖大量死亡的傳染性疾病的一種DNA病毒。在文章的第一部分，本論文以斑馬魚(yú)ISKNV感染模型研究了重組斑馬魚(yú)干擾素(zfrIFN1)對(duì)ISKNV引發(fā)的急性感染的抑制作用。這是在魚(yú)類(lèi)中首次分析干擾素對(duì)DNA病毒抑制作用研究，也是對(duì)魚(yú)類(lèi)干擾素在活體中抗病毒研究的補(bǔ)充。為了得到足量的干擾擾素，我們首先利用果蠅胚胎細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(Drosophila Expression

2、 System)篩選出穩(wěn)定表達(dá)重組斑馬魚(yú)干擾素的細(xì)胞系，誘導(dǎo)表達(dá)的含zfrIFN1的上清經(jīng)純化后，干擾素的活性在斑馬魚(yú)細(xì)胞虎紋蛙病毒(TFV)的感染模型中得到驗(yàn)證——重組干擾素可以有效抑制TFV感染及上調(diào)Mx基因表達(dá)。重組干擾素體內(nèi)抗病毒的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：腹腔注射zfrIFN1可以在24小時(shí)內(nèi)上調(diào)IFN刺激的基因如Mx、STAT1a、STAT-1b、STAT-2、IRF2、IRF7、IRF9、vig-1、PKZ和MHC-1等；與對(duì)照組相比

3、，這些宿主基因的表達(dá)在ISKNV感染3d后迅速降低，然而病毒基因MCP和VP48的轉(zhuǎn)錄在感染3d后仍然被抑制。為了評(píng)估zfrIFN1對(duì)ISKNV的保護(hù)效率，我們分析了不同時(shí)間點(diǎn)腹腔注射zfrIFN1對(duì)ISKNV導(dǎo)致的斑馬魚(yú)死亡的抑制作用，ISKNV感染前0，6，24 h，注射劑量為1μg/g魚(yú)重的zfrIFN1可以有效降低斑馬魚(yú)相對(duì)死亡率(RPS)；然而在ISKNV感染24小時(shí)后，等劑量的zfrIFN1不能提供有效的保護(hù)。據(jù)此，我們推測(cè)

4、干擾素在抗ISKNV感染中起重要作用，外源干擾素對(duì)病毒感染的抑制作用取決于病毒感染的進(jìn)程。
　　 IFN對(duì)病毒的抑制作用是典型的細(xì)胞免疫，在魚(yú)類(lèi)中，目前尚無(wú)直接的證據(jù)表明魚(yú)類(lèi)有介導(dǎo)體液免疫的細(xì)胞因子，如IL-4。在文章的第二部分，我們基于已報(bào)道的研究成果，利用5'RACE技術(shù)獲得了斑馬魚(yú)IL4/13B的全長(zhǎng)cDNA序列，結(jié)合斑馬魚(yú)IL4/13A序列，使用生物信息學(xué)的方法分析了斑馬魚(yú)兩種類(lèi)IL-4或IL-13基因(zfIL4/13

5、A和zfIL4/13B)編碼氨基酸的結(jié)構(gòu)特征和系統(tǒng)進(jìn)化等；利用3'RACE技術(shù)證實(shí)斑馬魚(yú)IL-4受體(IL-4R)基因存在兩種剪切方式：膜受體(IL-4RM)和可溶受體(IL-4RS)。利用免疫共沉淀技術(shù)，分析了zfIL4/13A和zfIL4/13B與IL-4RS的相互作用，為了鑒定zfIL4/13A和zfIL4/13B兩種蛋白的功能，我們同時(shí)分析了他們同IL-13Rα1和IL-13Rα2的相互作用，結(jié)果顯示，zfIL4/13A和zfI

6、L4/13B均可以和IL-4RS或IL-13Rα1發(fā)生免疫共沉淀，二者都不能與IL-13Rα2發(fā)生作用。為了進(jìn)一步區(qū)分zfIL4/13A和zfIL4/13B的功能，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)了兩者對(duì)IL-4激活基因(STAT6和MHCⅡ)的激活作用和對(duì)IFNγ的抑制作用，重組zfIL4/13A和zfIL4/13B均可上調(diào)STAT6和MHCⅡ表達(dá)，但zfIL4/13B的作用更為有效，zfIL4/13A對(duì)IL4/13B有激活作用。據(jù)此，我們推測(cè)