雞Piwi的亞細胞定位及其沉默效率的研究.pdf

1、Piwi基因主要存在于生殖細胞中，在生殖系干細胞的維持和精子發(fā)生方面發(fā)揮重要作用。其編碼的蛋白屬于Argonaute基因家族，Argonaute家族因參與RNA干擾而為人們所熟知。迄今為止，國內(nèi)外學者已在小鼠、果蠅、人、恒河猴、豬、新桿狀線蟲、鵪鶉等物種中對Piwi基因進行了一系列的研究，而對雞Piwi基因的研究甚少。本實驗以雞為模式動物，依據(jù)Piwi的cDNA序列，分別構(gòu)建了pEGFP-C1-Piwi和pcDNA3.1-Piwi兩種不

2、同的重組質(zhì)粒并用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染NIH-3T3細胞，利用免疫熒光技術(shù)定位PIWI蛋白在細胞內(nèi)的表達情況。同時以雞原始生殖細胞(PGCs)為實驗模型并構(gòu)建Piwi-shRNAs，采用RNAi技術(shù)轉(zhuǎn)染PGCs，運用Real-Time qPCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染24 h、48 h和72 h后PGCs中Piwi基因、生殖細胞形成和配子發(fā)生相關的調(diào)控因子(CVH、Dazl)以及調(diào)控干細胞多能性及自我更新的轉(zhuǎn)錄因子（Nanog、Sox2）的mRNA水平的相對表

3、達量。與此同時，將shRNA質(zhì)粒用于在活體-雞胚水平的干擾試驗，即采用雞胚盤下腔注射技術(shù)將Piwi-shRNAs注射到44-48h胚齡的雞胚體內(nèi)，采集注射5，12，19日齡的雞胚性腺樣品，檢測Piwi，及CVH、Dazl、Nanog、Sox2這四種基因的mRNA水平的表達量。為探討禽類Piwi基因的亞細胞定位及其在生殖干細胞和配子發(fā)生中的功能研究提供基礎依據(jù)。結(jié)果表明:
　　1.通過構(gòu)建兩組重組載體的研究發(fā)現(xiàn):利用pEGFP-C(

4、1)-Piwi載體檢測到整個細胞都發(fā)光，而使用pcDNA3.1-Piwi載體僅在細胞質(zhì)中檢測到有表達，與在線軟件預測結(jié)果相一致，與pEGFP-C1-Piwi相比，pcDNA3.1-Piwi載體實驗結(jié)果更可靠。表明免疫熒光技術(shù)更適合PIWI蛋白的定位研究。
　　2.細胞水平上的特異性shRNAs抑制實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn):24h后可檢測出明顯抑制，48 h達到高峰，72 h后開始減弱。在3個不同的時間點，空白對照組與陰性對照組相比均無顯著性差

5、異(P＞0.05)，且3組特異性shRNAs與陰性對照組相比，均具有顯著性差異(P＜0.05)。對于3組特異性shRNAs進行比較發(fā)現(xiàn)shRNA-2沉默效率最高，3組特異性shRNAs對雞Piwi基因的表達在不同時間均有不同程度的抑制作用，且抑制效果與shRNA序列相對于靶基因的位置和轉(zhuǎn)染時間長短相關。轉(zhuǎn)染48 h后的shRNA-2序列靶向抑制Piwi基因表達效率最高。
　　3.雞胚水平上的特異性shRNAs抑制實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn):在三

6、個時間點，陰性對照組與空白對照組相比，無明顯的差異(P＞0.05)，3組特異性shRNAs與陰性對照組相比，均具有顯著性差異(P＜0.05)，在注射后第5天時，Piwi基因的相對表達量均較低，在第12天時，干涉質(zhì)粒shRNA-2的Piwi相對表達量最低。三個時間點之間進行比較，出現(xiàn)明顯的抑制效果。在第19天時，抑制作用開始減弱。表明不同時間點的3組特異性的shRNAs對雞Piwi表達產(chǎn)生不同程度的抑制作用，且轉(zhuǎn)染時間的長短和shRNA序

7、列相對于靶基因的位置影響Piwi基因的抑制效果，shRNA-2序列的沉默效率最高，與細胞水平上的實驗結(jié)果一致。
　　4.Real-Time qPCR檢測PGCs細胞中CVH、Dazl及Nanog、Sox2的相對表達量顯示:與陰性對照組相比，抑制Piwi基因表達后，CVH、Dazl基因表達量上升，兩者之間差異顯著(P＜0.05)。而Nanog基因表達也上升，但差異不顯著。而Sox2基因表達量下降且差異顯著(P＜0.05)。在雞胚盤下