鴨疫里默氏菌感染耐過鴨血清免疫生物學活性研究.pdf

1、鴨疫里默氏菌（Riemerellaanatipestifer，RA）為革蘭氏陰性、短桿菌，是鴨、鵝、火雞等禽類傳染性漿膜炎(infectiousserocitis，IS)的病原，存在至少21種血清型。類似于RA菌落形態(tài)和生化特征的細菌很多。根據(jù)16SrDNA將這些細菌歸屬于黃桿菌科（Flavobacterius）里默氏屬（Riemerella），并細分為鴨疫里默氏菌種（Riemerellaanatipestifer，RA）和哥倫比亞里默

2、氏菌種(Riemerellacolumbina，RC)。鴨IS是鴨的常發(fā)病、多發(fā)病，8周齡內鴨高度易感，發(fā)病率為80％～100％，死亡率30％～70％。1、2、5等血清型是引起鴨IS主要流行血清型。雖然滅活疫苗和活疫苗可以有效地預防控制鴨IS流行，但是，目前我國養(yǎng)鴨場鴨IS流行仍然較為嚴重。如果我國政府進一步加大抗菌素藥物在肉鴨養(yǎng)殖中的禁用力度，該病流行將會更加嚴重，養(yǎng)鴨業(yè)將蒙受巨大經(jīng)濟損失。究其原因有，不同血清型RA菌株缺乏交叉免疫保

3、護，滅活疫苗免疫誘導長（10-14天），血清型變異快，耐藥性產(chǎn)生迅速等。本文報道RA抗體定量檢測方法和耐過鴨血清被動免疫保護試驗結果，旨在快速準確診斷流行血清型，為疫苗研制和使用提供監(jiān)測技術，進一步明確鴨SI的免疫保護機制，為改進疫苗效果，尤其是研制可避免血清型差異的通用型疫苗提供基礎理論依據(jù)。
　　1AF株
　　AF株系從鴨自然病例中分離的一株強毒力細菌，經(jīng)玻板凝集鑒定為RA血清2型，16SrDNA和協(xié)同溶血素（cohem

4、olysin,camp）基因PCR擴增產(chǎn)物1480bp和596bp，序列分析結果均證實屬于RA，用于本研究。
　　2.改良微量凝集試驗可用于鴨SI快速診斷流行血清型
　　凝集試驗（agglutinationtest，AT）是經(jīng)典免疫血清學技術。玻板AT廣泛用于RA血清型定性鑒定。微量凝集(Microagglutinationtest，MAT)以96孔‘V’型PVC板為載體，主要用于RA血清抗體效價定量檢測。常規(guī)MAT存在凝集

5、與未凝集結果判定困難，檢測結果敏感性不高等問題。改良MAT方法是，RA以兔血巧克力LB平板培養(yǎng)，生理鹽水(PS)懸浮細菌，0.5％甲醛滅活，復紅染色即制成MAT抗原。反應總體積為50μL。采取斜立近乎垂直觀察‘下滑線’區(qū)別凝集與未凝集現(xiàn)象。改良MAT檢測結果是，健康非免鴨76.5％個體抗體效價為0，其余為1log2;滅活疫苗免疫后14-22天血清抗體效價為2～5log2，70％個體為效價為2～3log2。攻毒后，疫苗免疫組無發(fā)病，但抗體

6、效價于第2天上升1-2個滴度，即效價范圍為2～5log2。未接種疫苗的攻毒對照組100％發(fā)病，有20％～90％的死亡率，攻毒后7天存活的耐過鴨效價范圍為3～8log2，超過5log2的個體比例占73.9％。研究結果提示，改良MAT背景值低于1log2，滅活疫苗免疫鴨效價低于5log2，而感染發(fā)病后的耐過鴨血清效價大于5log2的比例很高。據(jù)此提出，耐過鴨群檢測MAT效價可以快速診斷流行的RA血清型。
　　3.RA感染耐過鴨非凝集類

7、抗體是主要免疫保護抗體
　　22日齡易感鴨隨機分為4組，分別注射健康鴨血清、RA感染耐過鴨血清、RA滅活疫苗免疫后攻毒發(fā)病耐過鴨（下簡稱免疫攻毒耐過鴨）血清和PS，每只3.0mL，24h后攻毒。結果是，PS組和健康鴨血清組100％發(fā)病，死亡率(mortality，Mt)分別為56％(5/9)和20％(1/5)，耐過鴨血清組無發(fā)病、無死亡，免疫攻毒鴨血清組發(fā)病20％(1/5)，無死亡。重復試驗結果是，PS組和健康血清組100％發(fā)病，

8、Mt為37.5％(5/14)和60％(3/5)，耐過鴨血清組無發(fā)病、無死亡，免疫攻毒鴨血清組發(fā)病100％(5/5)，無死亡。結果表明，RA感染耐過鴨血清具有良好的免疫保護效果。
　　混合耐過鴨血清（MAT效價為5log2）56℃水浴30min處理、活菌菌體抗原吸附4-5次除去凝集抗體（MAT檢測效價為0）并56℃水浴30min處理及稀釋4倍（MAT檢測為3log2）注射1mL/只(劑量為其他組的1/3)發(fā)病率分別為0、0和22.2

9、％(2/9)，Mt均為0，即無死亡。同時設置的PS組和健康鴨血清組100％發(fā)病，Mt為33.3％(3/9)和0％。結果顯示，RA耐過鴨血清中的非凝集性抗體為主要保護性抗體，且生物活性高，不受56℃水浴30min影響。MAT效價與被動免疫保護效果存在間接相關性。
　　4.AF株生長凝集-解凝集生長現(xiàn)象
　　RA耐過鴨血清（MAT效價為6log2）無菌檢驗合格后，取100μL加入1.9mLLB肉湯中，培養(yǎng)AF株。觀察到，接種后2

10、h，出現(xiàn)小的絮狀凝集塊，溶液透明，4-5h凝集塊最多，呈大片狀，溶液透明，5-6h凝集塊開始解散，溶液變乳白色，6-7h后凝集塊完全消失，溶液渾濁快速增加。測定A525值發(fā)現(xiàn)，凝集塊消散后，數(shù)值呈對數(shù)增加，至12h達最大值，即2.2以上。凝集塊的出現(xiàn)與MAT效價有關，低于4log2的血清試管，凝集塊模糊。健康鴨血清對照組未見凝集塊出現(xiàn)，但細菌生長至12h時，A525也達峰值。無鴨血清的LB組，細菌生長緩慢，A525峰值出現(xiàn)在24h左右。

11、結果表明，耐過鴨血清組出現(xiàn)的凝集塊具有特異性，鴨血清對RA的生長具有促進作用。本文將RA一邊生長并同時與抗體發(fā)生特異凝集反應，之后凝集塊消散，細菌快速生長現(xiàn)象歸納為生長凝集-解凝集生長(growthagglutinationanddeagglutinationgrowth，GADAG)現(xiàn)象。RA發(fā)生這一新現(xiàn)象的機制尚待研究。
　　GADAG過程中細菌鏡檢形態(tài)發(fā)生變化。在凝集期，AF株聚集成塊，菌體形態(tài)變短，幾近球形。凝集塊消散后，