大豆主要致敏原的免疫檢測研究.pdf

1、通過切膠回收純化獲得純度93％的大豆β-伴球蛋白α亞基,作為抗原制備出α亞基多克隆抗體PcAb-60K-A;用生物信息學方法對α亞基抗原表位進行預測,選取其特異的抗原表位85EQDERQFPFPR95作為半抗原,進行人工合成后,分別與載體蛋白KLH和BSA偶聯(lián)作為免疫抗原和包被抗原,制備出α亞基特異多克隆抗體PcAb-60K-B和單克隆抗體McAb-60K(屬于輕鏈為κ的IgG1,效價約為67,000)；PcAb-60K,-A識別β-伴

2、球蛋白α同時,還與α’亞基產(chǎn)生交叉反應,而PcAb-60K-B和McAb-60K能實現(xiàn)對α亞基的特異識別,而與包括β-伴球蛋白α’和β亞基在內(nèi)的豆粕其他蛋白沒有交叉反應；以McAb-60K和合成的包被抗原為工具,建立了定量檢測大豆及豆粕中α亞基的競爭酶聯(lián)免疫吸附法,該方法有效檢測范圍在0.65-29.84 ng／mL,IC50能達到4.42ng／mL,具有較好的準確性和可重復性。
　　 人工合成大豆致敏蛋白P34的cDNA全長序

3、列,通過原核表達系統(tǒng)pET-28a(+)和His親和層析,獲得純度超過92％的P34融合蛋白；以P34融合蛋白為抗原成功制備出P34特異多克隆抗體PcAb-P34,效價能夠達到729,000,并且與豆粕中其他蛋白沒有交叉反應；用P34融合蛋白和PcAb-P34建立了大豆P34蛋白的間接酶聯(lián)免疫吸附法,其標準曲線R2為0.9831,在一定范圍內(nèi)具有較高精密度和可重復性。
　　 人工合成大豆致敏蛋白Gly m Bd28K的cDNA全

4、長序列,通過原核表達系統(tǒng)pET28a-28a(+),表達了Gly m Bd28K融合蛋白,經(jīng)His親和層析,獲得純度超過90％的融合蛋白；以Gfy m Bd28K融合蛋白為抗原,制備出Gly m Bd28K特異多克隆抗體PcAb-28K,效價能夠達到27,000,并且與豆粕中其他蛋白沒有交叉反應；以純化的Gly m Bd28K融合蛋白和PcAb-28K建立了大豆Gly mBd28K蛋白的間接酶聯(lián)免疫吸附檢測法,其標準曲線R2為0.991

5、0,在一定范圍內(nèi)具有一定精密性和重復性。
　　 用本研究建立的免疫檢測方法檢測顯示,α亞基、具致敏活性的P34和Gly m Bd28K在大豆種子中含量分別為46.8μg／mg、4.62μg／mg和2.96μg／mg:在豆粕中分別為8.9μg／mg、3.91μg／mg和1.21μg／mg。經(jīng)發(fā)酵處理的豆粕中α亞基、具致敏活性的P34和Gly m Bd28K含量都被顯著降低。釀酒酵母對α亞基分解效率最高,然后是產(chǎn)朊假絲酵母、扣囊擬內(nèi)

6、孢霉、白地霉和枯草芽孢桿菌；產(chǎn)朊假絲酵母和釀酒酵母對P34發(fā)酵脫敏效率最高,然后是扣囊擬內(nèi)孢霉、白地霉和枯草芽孢桿菌,釀酒酵母、產(chǎn)朊假絲酵母和扣囊擬內(nèi)孢霉發(fā)酵72 h豆粕中都未檢出P34蛋白；產(chǎn)朊假絲酵母和釀酒酵母對Gly m Bd28K脫敏效果最好,然后是扣囊擬內(nèi)孢霉、白地霉和枯草芽孢桿菌,這5種菌發(fā)酵72 h豆粕中都未檢出具致敏活性的Gly m Bd28K。
　　 此外,本研究還用人工合成的大豆球蛋白A1a和A3酸性多肽基因