刺參鹽度相關(guān)基因的干擾及功能研究.pdf

1、刺參(Apostichopus japonicus)是我國(guó)重要的名貴海珍產(chǎn)品，隨著刺參養(yǎng)殖規(guī)模不斷的擴(kuò)大，養(yǎng)殖刺參出現(xiàn)種質(zhì)資源退化、抗病能力顯著下降以及由水溫和鹽度等因素導(dǎo)致的減產(chǎn)、病害以及生長(zhǎng)緩慢等問(wèn)題。特別是在雨季時(shí)，地處江河附近的刺參池塘極易受到降雨影響而導(dǎo)致海水鹽度降低，造成刺參大量的發(fā)病和死亡，給刺參養(yǎng)殖業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失。本文通過(guò)刺參的溶菌酶基因（lysozyme gene, LYZ）、Na+,K+-ATPase基因(Na

2、+,K+-ATPase gene, NKA)及NKCC1基因等的體內(nèi)RNA干擾試驗(yàn)，研究其在刺參鹽度適應(yīng)性狀中的功能，為刺參健康可持續(xù)養(yǎng)殖奠定基礎(chǔ)。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴構(gòu)建了溶菌酶基因的Rip-LYZ-1、Rip-LYZ-2、Rip-LYZ-3， Na+,K+-ATPase基因的Rip-NKA-1、Rip-NKA-2、Rip-NKA-3和NKCC1基因的Rip-NKCC-1、Rip-NKCC-2、Rip-NKCC-3 RN

3、A干擾重組質(zhì)粒。以培養(yǎng)的刺參體腔液原代細(xì)胞為靶細(xì)胞檢測(cè)RNA干擾重組質(zhì)粒對(duì)其靶基因的沉默效率，通過(guò)測(cè)定其靶基因的相對(duì)表達(dá)量和酶活性變化來(lái)篩選最佳干擾質(zhì)粒。結(jié)果顯示：Rip-LYZ-1、Rip-LYZ-2和Rip-LYZ-3的沉默效率為40％、45%、0%，Rip-NKA-1、Rip-NKA-2和Rip-NKA-3的沉默效率為32%、46%、39%，Rip-NKCC-1、Rip-NKCC-2和Rip-NKCC-3的沉默效率為18%、51%

4、、11%；此外， Rip-LYZ-2和Rip-NKA-2均對(duì)其靶基因的表達(dá)量和酶活性產(chǎn)生了極為顯著的（P<0.01）抑制作用。上述結(jié)果為后續(xù)的刺參體內(nèi)RNA干擾試驗(yàn)提供了重要的參考依據(jù)。⑵以Rip-LYZ-2為干擾質(zhì)粒進(jìn)行LYZ基因的體內(nèi)RNA干擾。分別以口腔注射和體腔注射的方式轉(zhuǎn)染等量的Rip-LYZ-2，48小時(shí)后提取刺參體腔液、肌肉和管足組織用于測(cè)定各試驗(yàn)組LYZ基因的表達(dá)量變化情況。結(jié)果顯示：口腔注射組中，體腔液、肌肉和管足中L

5、YZ基因的相對(duì)表達(dá)量分別為0.58、0.24和1.6；腹腔注射組中，體腔液、肌肉和管足中LYZ基因的相對(duì)表達(dá)量分別為1.3、560和0.27。表明從口腔注射RNA干擾重組質(zhì)粒能夠獲得更為穩(wěn)定的RNA干擾效應(yīng)和更高的沉默效率。⑶以口腔注射的方式分別注射0.5μg、5μg、10μg和25μg的Rip-LYZ-2。48小時(shí)后提取刺參體腔液、肌肉和管足組織用于測(cè)定各試驗(yàn)組LYZ基因的表達(dá)變化情況。結(jié)果顯示：注射劑量為0.5μg時(shí)，刺參體腔液、肌

6、肉和管足LYZ基因的相對(duì)表達(dá)量分別為1.38、2.69和4.92；注射劑量為5μg時(shí)，刺參體腔液、肌肉和管足LYZ基因的相對(duì)表達(dá)量分別為2.24、0.78和4.55；注射劑量為10μg時(shí)，刺參體腔液、肌肉和管足LYZ基因的相對(duì)表達(dá)量分別為0.08、1.17和0.15；注射劑量為25μg時(shí)，刺參體腔液、肌肉和管足LYZ基因的相對(duì)表達(dá)量分別為0.6、0.13和0.04。表明：當(dāng)RNA干擾重組質(zhì)粒的注射劑量達(dá)到10μg及以上時(shí)，對(duì)刺參體內(nèi)靶基

7、因的表達(dá)形成了較為穩(wěn)定的RNA干擾效應(yīng)。⑷以口腔注射的方式轉(zhuǎn)染Rip-LYZ-2，并分別在轉(zhuǎn)染后0 h、12 h、24 h、48 h、4 d和8 d后提取刺參體腔液、肌肉、體壁、疣足和管足組織，對(duì)LYZ基因表達(dá)量和溶菌酶活性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示：體腔液和肌肉中 LYZ基因表達(dá)量在前48 h呈下降趨勢(shì)，之后其表達(dá)量快速上升，體腔液中溶菌酶活性則持續(xù)下降，肌肉中溶菌酶活性一開(kāi)始即上升，而在24 h和48 h未檢測(cè)到溶菌酶活性，之后溶菌酶活性快

8、速上升；體壁中 LYZ基因表達(dá)量及其酶活性的變化趨勢(shì)基本一致，總體上呈先上升后下降再上升的趨勢(shì)；疣足中 LYZ基因表達(dá)量及其酶活性在前48 h未出現(xiàn)顯著變化，并分別在48 h達(dá)到最小值，之后開(kāi)始回升；管足中LYZ基因的表達(dá)量在12 h顯著上升(P<0.05)，之后其表達(dá)量快速下降，并于48 h后逐步回升，其酶活性一開(kāi)始即快速上升，在12 h后酶活性持續(xù)下降。表明刺參的RNA干擾效應(yīng)具有系統(tǒng)性，即局部注射干擾質(zhì)粒能夠在動(dòng)物個(gè)體的不同組織和

9、器官引起靶基因表達(dá)的降低，且miRNA介導(dǎo)的刺參體內(nèi)RNA干擾效應(yīng)能夠持續(xù)四天左右。⑸分別進(jìn)行低鹽脅迫條件下LYZ、NKA和NKCC1基因的體內(nèi)RNA干擾實(shí)驗(yàn)。在轉(zhuǎn)染后0 h、12 h、24 h、48 h、72 h和96 h抽取刺參體腔液用于測(cè)定基因的表達(dá)變化情況。結(jié)果顯示：LYZ試驗(yàn)組的LYZ基因表達(dá)量在24 h和72 h時(shí)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，而其酶活性在24 h和48 h時(shí)亦顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，NKA和NKC

10、C1的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；NKA試驗(yàn)組的NKA基因表達(dá)量在12 h和24 h時(shí)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，其酶活性在24 h和96 h時(shí)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，NKCC1的表達(dá)量在12 h到72 h間顯著低于對(duì)照組， LYZ的表達(dá)量和酶活性在部分時(shí)刻亦低于對(duì)照組；NKCC試驗(yàn)組NKCC1和NKA的表達(dá)量分別在前48 h和24 h顯著低于對(duì)照組；此外，通過(guò)測(cè)定各對(duì)照組和試驗(yàn)組刺參體腔液中 Na+、K+和Cl-