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文檔簡介
1、蝦青素(astaxanthin)是一種氧化型酮式紅色類胡蘿卜素,與其前體物質(zhì)β-胡蘿卜素和玉米黃素相比,具有更強(qiáng)的抗光氧化能力。蘋果營養(yǎng)豐富,經(jīng)濟(jì)價值高,是世界上主要栽培樹種之一。蘋果果實(shí)在生長發(fā)育期間常出現(xiàn)日燒現(xiàn)象,通常蘋果日燒是由于果實(shí)在溫度逆境和強(qiáng)光下發(fā)生的光氧化傷害所致。如果能把蘋果中的β-胡蘿卜素和玉米黃素變成蝦青素,則有可能在一定程度上提高果實(shí)的抗光氧化、抗日燒能力,同時還可改善果實(shí)色澤,對于進(jìn)一步提高果實(shí)的營養(yǎng)品質(zhì)和商品價
2、值有重要意義。
β-胡蘿卜素酮化酶(BKT)和β-胡蘿卜素羥化酶(CRTR-B)是蝦青素生物合成的關(guān)鍵酶,本研究將bkt基因和crtR-B基因構(gòu)建到載體上獲得植物表達(dá)載體,并通過凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105獲得工程菌株。以‘Brookfield嘎拉’蘋果葉片為受體,由工程菌介導(dǎo)對其進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化,有望通過調(diào)控代謝途徑,在蘋果中合成蝦青素。具體研究結(jié)果如下:
1.用高效液相色譜法(HPLC)測定了蘋果果實(shí)中β-胡
3、蘿卜素的含量。結(jié)果表明,不同品種β-胡蘿卜素含量不同,煙富3中β-胡蘿卜素含量>皇家嘎啦>綠色品種塔斯坎;同一品種不同品系也不同,早熟富士紅將軍>條紅煙富3>片紅煙富6;果皮中β-胡蘿卜素含量高于果肉;煙富3套袋果β-胡蘿卜素含量顯著低于非套袋果,果皮和果肉中分別降低了30.43%和4.38%。果實(shí)中β-胡蘿卜素含量的測定為以β-胡蘿卜素為底物合成蝦青素的遺傳轉(zhuǎn)化提供了依據(jù)。
2.構(gòu)建了植物表達(dá)載體p1301-bkt和p1
4、301-bkt-crtR-B。用bkt基因替換pBI221中的GUS基因形成含有CaMV35S啟動子和NOS終止子的bkt基因表達(dá)盒,然后插入植物表達(dá)載體pCAMBIA1301中,獲得植物表達(dá)載體p1301-bkt;再用crtR-B基因替換載體p1301-bkt中的GUS基因,獲得雙價植物表達(dá)載體p1301-bkt-crtR-B。轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105,獲得工程菌EHA105/p1301-bkt和EHA105/p1301-bkt-c
5、rtR-B。
3.研究了影響遺傳轉(zhuǎn)化的主要因素如激素種類和濃度、抗生素篩選、農(nóng)桿菌侵染等對‘Brookfield嘎啦’葉片再生的影響,同時研究了抗生素Km和Hm對試管苗增殖和生根的影響,為后面工程菌介導(dǎo)的蘋果遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明:TDZ誘導(dǎo)葉片再生芽數(shù)顯著高于6-BA,最佳濃度配比為TDZ1.0 mg/L、NAA0.4 mg/L;嘎啦蘋果對抗生素Km和Hm均很敏感,葉片再生最佳Km和Hm選擇壓為10 mg/L和3 m
6、g/L,試管苗增殖為40 mg/L和4 mg/L,生根為5 mg/L和2 mg/L; Cef濃度小于600 mg/L時,對葉片再生芽數(shù)的影響不明顯;農(nóng)桿菌侵染對葉片傷害較大,與對照相比顯著降低了葉片再生芽數(shù)。
4.以蘋果無菌試管苗葉片為受體,以工程菌EHA105/p1301-bkt介導(dǎo)蘋果遺傳轉(zhuǎn)化時,共獲得9株轉(zhuǎn)化植株(R1-R9)和部分抗性愈傷組織,GUS染色、PCR和RT-PCR檢測結(jié)果表明其中有8株(R1,R2,R3
7、,R4,R6,R7,R8,R9)bkt基因已整合到轉(zhuǎn)基因植株基因組中并獲得了表達(dá),表型觀察初步斷定能以玉米黃素為底物合成蝦青素。
5.以工程菌EHA105/p1301-bkt-crtR-B介導(dǎo)蘋果遺傳轉(zhuǎn)化時,共獲得7株轉(zhuǎn)基因植株和部分抗性愈傷組織,經(jīng)PCR、RT-PCR和Southern blotting檢測,結(jié)果表明:有4株(G1,G4,G5,G7)bkt和crtR-B基因均整合到蘋果基因組中并在基因組中得到了表達(dá);有1
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