家兔類胚胎干細胞分離培養(yǎng)及羊棲菜多糖對其生長增殖和分化的影響.pdf

1、本試驗的旨在分離培養(yǎng)獲得家兔類胚胎干細胞及研究羊棲菜多糖對家兔類ES細胞生長增殖和分化的影響，從細胞水平探討SFPS的營養(yǎng)作用和藥理功能。通過研究SFPS對家兔類ES細胞飼養(yǎng)層生長增殖和細胞因子分泌的影響及其對家兔類ES細胞物質(zhì)合成、抗氧化和分化的作用，揭示SFPS調(diào)節(jié)家兔類胚胎干細胞生長增殖的作用機理，闡明SFPS對家兔類ES細胞誘導分化為肝細胞的作用。 1.從13-15dpc家兔胎兒生殖嵴分離出原始生殖細胞培養(yǎng)于小鼠胎兒成纖

2、維細胞(MEF)飼養(yǎng)層和家兔胎兒成纖維細胞(REF)飼養(yǎng)層，以胰蛋白酶消化法和機械分離-胰蛋白酶消化法進行傳代，并對培養(yǎng)得到的家兔類ES細胞進行鑒定。結果表明：以MEF作為飼養(yǎng)層，用機械分離.胰蛋白酶消化法傳代，更有利于家兔類ES細胞的體外培養(yǎng)，最高傳至6代，培養(yǎng)得到的家兔類胚胎干細胞AKP染色和PAS染色陽性，保持完整的染色體組(2n=44)，具有多分化潛能，可形成類胚體，可分化為上皮樣細胞、脂肪細胞、心肌細胞、神經(jīng)樣細胞。

3、2.用含5、10、20、40、80mg/LSFPS的培養(yǎng)液培養(yǎng)家兔類ES細胞飼養(yǎng)層(即MEF)，研究SFPS對MEF生長增殖、營養(yǎng)物質(zhì)吸收利用和細胞因子分泌的影響。結果表明：5、10、20mg/LSFPS對MEF形態(tài)和生長增殖無顯著影響(P>0.05)，40、80mg/LSFPS對MEF表現(xiàn)出明顯的抑制作用(P<0.05)，使MEF突觸分叉，細胞內(nèi)顆粒增多；SFPS可顯著促進MEF對葡萄糖的攝取利用(P<0.05)，但對鈣和氨基酸的利用

4、無顯著影響(P>0.05)；低濃度SFPS有促進MEF堿性成纖維細胞因子(bFGF)、干細胞生長因子(SCF)、白血病抑制因子(LIF)分泌的趨勢，但高濃度SFPS有減少MEF分泌bFGF、SCF和LIF的的趨勢。 3.用不同濃度SFPS培養(yǎng)家兔類ES細胞，觀察家兔類ES細胞的形態(tài)和生長行為，測定其集落數(shù)和傳代數(shù)，以及家兔類ES細胞蛋白質(zhì)、DNA、RNA的含量。結果表明：5、10、20mg/L SFPS對家兔類ES細胞的生長增殖

5、有促進作用，集落數(shù)量多，體積大，最高傳至7代，40、80mg/LSFPS對家兔類ES細胞發(fā)生毒性作用，集落數(shù)量減少，易分化，傳3-4代后丟失。SFPS對家兔類ES細胞蛋白質(zhì)的含量無顯著影響(P>0.05)，5、10、20mg/L SFPS可顯著提高家兔類ES細胞DNA、RNA含量(P<0.01)，40、80mg/LSFPS對家兔類ES細胞DNA含量無顯著影響(P>0.05)，但顯著降低RNA的含量(P<0.01)。 4.以H2O

6、2為家兔類ES細胞外源性氧化劑，制備氧化損傷模型，并用不同濃度SFPS對家兔類ES細胞進行保護和修復，探討SFPS對家兔類ES細胞的抗氧化作用。結果顯示：5、10、20mg/LSFPS對家兔類ES細胞具有保護和修復作用，可顯著提高氧化損傷家兔類ES細胞的增殖活力以及SOD和GSH-Px酶活性，減少MDA的產(chǎn)生，抑制H2O2導致的DNA斷鏈。40、80 mg/LSFPS對氧化損傷家兔類ES細胞的保護和修復作用不明顯，有時反而加劇對家兔類E

7、S細胞的損傷，對DNA斷鏈的抑制作用較弱。 5.以家兔胎肝提取液為肝細胞誘導分化劑，同時與SFPS聯(lián)合使用誘導家兔類胚胎干細胞向肝細胞分化，探討SFPS對家兔類胚胎干細胞誘導分化為肝細胞的影響。結果顯示：胎肝提取液可誘導家兔類胚胎干細胞分化為肝細胞，誘導分化細胞呈圓形、星形、不規(guī)則多邊形，具有糖原貯存、ICG攝取和排泄功能，能夠合成白蛋白和尿素。并且家兔類胚胎干細胞在體外也能自發(fā)分化為肝細胞，但分化率較低。低濃度SFPS對胎肝提

8、取液誘導家兔類胚胎干細胞分化為肝細胞有一定促進作用，可提高分化細胞PAS染色和ICG攝取陽性率，促進誘導分化形成的肝細胞白蛋白和尿素的合成。 綜上所述，從胎兒生殖嵴分離培養(yǎng)的家兔類胚胎干細胞具有胚胎干細胞的特征。并且，低濃度SFPS促進家兔類ES細胞的生長增殖，高濃度SFPS起抑制作用，SFPS促進飼養(yǎng)層細胞分泌細胞因子，同時發(fā)揮抗氧化作用可能是其促進家兔類ES細胞生長增殖的作用機理。低濃度SFPS對胎肝提取液誘導家兔類胚胎干細